温中健脾、清热燥湿法对TNBS/无水乙醇诱导的溃疡性结肠炎（寒热错杂证）模型大鼠Occludin蛋白的影响*

石 磊 韩亚飞 贾博宜 孙中美 原文静 丁庞华 郭 一 谢添弘 陈 晨 李军祥△

（1.北京中医药大学，北京 100029；2.北京中医药大学东方医院，北京 100078）

溃疡性结肠炎（UC）是一种由基因、免疫、心理、环境等多因素参与引起的肠道疾病，临床以黏液脓血便、腹痛、里急后重为主［1］。目前多数观点认为由机械、化学、生物和免疫屏障组成的肠屏障遭到破坏在UC发病中起到了重要的作用［2］。5-氨基水杨酸制剂为轻中度UC的主要治疗药物，但在使用中发现其诱导缓解效率较低、患者依从性差，更无法缓解患者腹部怕凉、手足不温、体质量下降等症状。中医药辨证论治用药灵活，在减轻UC病情、预防复发方面具有较明显的优势［3］，而这可能与复方多靶点调控相关机制有关。紧密连接是保证机械屏障正常功能的基本结构，Occludin蛋白作为其中的重要组成部分，在维系上皮细胞极性、维持紧密连接完整结构方面起关键作用［4］。目前尚未见到从温中健脾、清热燥湿角度探讨扶正祛邪法通过改善Occludin蛋白表达发挥疗效的相关报道。因此本研究拟从温中健脾、清热燥湿角度立法，研究代表方清肠温中方对寒热错杂证UC大鼠及Occludin蛋白的作用影响，为温中健脾、清热燥湿法治疗溃疡性结肠炎（寒热错杂证）临床应用提供科学依据，为溃疡性结肠炎的中医药治疗提供新的治疗思路。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级健康雄性SD大鼠70只，体质量（200±20）g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2016-0002，饲养于北京中医药大学SPF级动物房，12 h/12 h光照/黑暗循环，温度（22±2）℃，湿度50%～60%，自由饮食饮水。

1.2 药物与试剂 清肠温中浸膏方 （黄连6 g，炮姜10 g，三七6 g，木香6 g，炙甘草6 g等）由北京中医药大学中药学院提供。阳性对照中药乌梅丸（乌梅16 g，细辛 6 g，干姜 10 g，黄柏 6 g，桂枝 6 g，黄连 16 g，当归 4 g，附子 6 g，川椒 4 g，人参 6 g），购自北京中医药大学东方医院颗粒剂药房。阳性对照西药美沙拉秦缓释颗粒（艾迪莎，国药准字H20143164），购自北京中医药大学东方医院药房；5%TNBS（w/v）（P2297）购自美国Sigma公司。4%多聚甲醛、无水乙醇购自中农博信（北京）科技有限公司；Anti-Occludin（ab31721）抗体购自美国Abcam公司。

1.3 分组与造模 SD大鼠适应性饲养1周，采用随机数字表法将70只大鼠随机分为空白组、模型组、清肠温中方高剂量组（2.0 g浸膏/kg）、清肠温中方中剂量组（1.0 g 浸膏/kg）、清肠温中方低剂量组（0.5 g 浸膏/kg）、美沙拉秦组（400 mg/kg）和乌梅丸组（8.4 g生药/kg）共7 组，每组 10 只。 采用 2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）/无水乙醇改良复合法复制UC模型［5］。除空白组外，所有大鼠禁食不禁水12 h，10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射以麻醉大鼠，将石蜡油浸润婴儿10 cm圆头灌肠管，由肛门缓慢插入8 cm，将终浓度33.3%无水乙醇的 TNBS（100 mg/kg）溶液0.6mL一次性于 1 min内缓慢推注入内，每只大鼠使用新灌肠管。保持仰卧位15 min后，放回笼内棉花保暖至清醒，共3 d，每日1次。

1.4 给药方法 实验第4日起，除空白组外，所有大鼠连续10 d以相应药物灌胃干预（1 mL/100 g），清肠温中浸膏方高、中、低剂量组分别以2.0 g浸膏/kg（临床患者2倍用量）、1.0 g浸膏/kg（临床患者用量）、0.5 g浸膏/kg（临床患者0.5倍用量）；美沙拉秦组以400 mg/kg（临床患者用量）；模型组以蒸馏水灌胃。

1.5 标本采集与检测 实验期间每日记录大鼠体质量，观察一般情况和便质，化验便潜血。实验第14日以10%水合氯醛（0.4 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，在装有碎冰的培养皿中迅速进行全结肠截取，将骨盆剪开彻底暴露盆腔，从肛门到膨大的回盲部全部取出，于PBS缓冲液中迅速涮洗并纵向剖开，根据CDMI评分标准进行评分。分离远端结肠（距肛门10 cm）2 cm，于4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，片厚4 μm，抗原修复后采用DAB显色法免疫组化染色观察Occludin蛋白表达。采用Image J软件（1.37c NIH，USA）对染色结果进行分析计算，平均光密度值（AOD＝IntDen/Area）表示目标蛋白的具体染色情况。

1.6 观察指标 1）疾病活动指数（DAI）［6］。 体质量下降率：无下降0分；1%～5%记1分；5%～10%记2分；10%～15%记3分；大于15%记4分。便质：正常0分，稀软便2分；水样便4分；便潜血：阴性0分；阳性2分；肉眼血便 4 分。 2）结肠黏膜损伤指数（CMDI）［3］。 0分为无损伤；1分为无溃疡；2分为肠壁变厚，无溃疡；3分为有溃疡，直径＜1 cm；4分为有溃疡，直径＞1 cm，肠管与周围组织无粘连；5分为有溃疡，直径＞1 cm，肠管与周围组织有粘连。3）结肠组织病理学评分［4］。炎细胞浸润：0分为无浸润；1分为轻度；2分为中度；3分为重度。肉芽肿：0分为无；1分为轻度；2分为中度；3分为重度。病变深度：0分为黏膜层；1分为黏膜下层；2分为肌层；3分浆膜层。

1.7 统计学处理 应用 SPSS22.0（IBM，USA）统计软件。符合正态分布的计量资料以（±s）表示，用单因素方差分析进行检验，方差齐用LSD法，不齐用T2法。不符合正态分布的计量资料及计数资料用中位数 （四分位数间距）描述，用独立样本非参数检验的K-W检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组DAI分类及大鼠一般情况比较 模型复制期间，除空白组大鼠外，均出现潜血阳性情况，后期逐渐出现血便表现并持续天数较长，可同时伴有粪便不成形或淡黄色黏液果胶形状，症状持续至停药后2~3 d。严重者肛门因便血量大、血液凝固后肛周皮毛潮湿、色黑，大鼠精神状态低下，蜷缩抱团，部分大鼠可见不自主颤栗现象。结合下利脓血、肛周潮湿以及畏寒抱团的大体症状，考虑该方法复制的大鼠UC模型，符合寒热错杂证。

随后清肠温中方中剂量组、美沙拉秦组和乌梅丸组大鼠逐渐呈现好转情况，血便减少或消失，粪便逐渐成形，一般状态较前好转，食欲增加。体质量变化率方面，几组之间尚不存在统计学差异。便潜血和便质情况上，模型组评分均明显高于空白组（P＜0.01）；而与模型组比较，清肠温中方中剂量、美沙拉秦和乌梅丸组大鼠评分均有所降低（P＜0.05），以上结果见表1。实验期间空白组大鼠无死亡，模型组死亡4只，清肠温中方高、低剂量组各死亡3只，清肠温中方中剂量组、美沙拉秦组和乌梅丸组各死亡2只。

表1 各组大鼠实验终点DAI分类评分表［中位数（四分位数间距）］

2.2 各组大鼠日均体质量比较 见表2。随着模型复制的进行，所有造模大鼠体质量均呈明显下降，且造模期间每组均有大鼠死亡，体质量下降趋势持续至造模停药后2~3 d。随着药物干预治疗日期的延长，除模型组外其余大鼠食欲较前好转，体质量均能有所增加，死亡情况也明显少于模型组。模型组大鼠体质量持续下降，实验终点体质量较空白组明显减轻（P＜0.01）。清肠温中方中剂量组、乌梅丸组大鼠与模型组相比，体质量增长最明显（P＜0.01），美沙拉秦组体质量也有所增加（P＜0.05）。

2.3 各组Occludin蛋白表达比较 免疫组化染色后可以发现（图1），空白组大鼠结肠组织表达大量Occludin蛋白，且表达位置主要位于细胞膜，模型组由于肠道结构紊乱消失，与空白组比较，Occludin蛋白表达也明显减少（P＜0.01）。经药物干预后，与模型组相比，清肠温中方中剂量组和美沙拉秦组能明显上调Occludin表达（P＜0.01），其余各组也能使该蛋白表达上调（P＜0.05），阳性染色Occludin蛋白平均光密度值见表2。

表2 各组大鼠日均体质量、结肠Occludin蛋白表达比较（±s）

表2 各组大鼠日均体质量、结肠Occludin蛋白表达比较（±s）

组 别 n空白组 10模型组 6日均体质量（g） AOD（平均光密度值）347.83±29.98 0.717±0.035 176.36±7.03* 0.303±0.025*高剂量组 7 248.26±7.91 0.513±0.021△中剂量组 8 270.92±26.22△△ 0.613±0.045△△低剂量组 7 250.76±24.51 0.510±0.036△美沙拉秦组 8 268.22±34.82△ 0.603±0.031△△乌梅丸组 8 279.52±41.37△△ 0.543±0.035△

图1 各组大鼠结肠Occludin蛋白免疫组化图（DAB染色，200倍）

2.4 各组结肠CMDI评分比较 见表3。模型组大鼠结肠高度粘连，脆性大，触碰易出血和折断，严重者与腹腔部分粘连，剖开肠道可见多处较大圆形斑片状溃疡，结肠明显缩短，评分与空白组相比，明显升高（P＜0.01）。与模型组相比：美沙拉秦组能较明显地改善溃疡分布和大小（P＜0.05），清肠温中方各剂量组和乌梅丸组也均能减轻溃疡，但水肿、肠道增厚情况未能明显改善（P＞0.05）。

2.5 各组结肠组织病理学评分比较 见表3。HE染色观察结肠组织（图2）可见模型组肠道黏膜的4层结构消失，隐窝结构紊乱消失，伴大量中性粒细胞浸润全视野，炎症程度严重，评分与空白组比较明显升高（P＜0.01）。清肠温中方中剂量组和美沙拉秦组可见整齐的4层结构。可见清晰的隐窝和较多规律分布的杯状细胞，中性粒细胞浸润以黏膜层为主，少有黏膜下层浸润，偶见嗜酸性粒细胞，与模型组相比，评分明显降低（P＜0.01）。其余各组均有好转趋势，组织学改变介于上述两者情况之间，但与模型组比较，尚不存在统计学差异。

表3 各组大鼠结肠CMDI评分、结肠组织病理学评分表［分，中位数（四分位数间距）］

图2 各组大鼠结肠组织病理学图（HE染色，200倍）

3 讨 论

肠上皮细胞（IECs）的完整性缺失和肠屏障渗透性增高会导致UC发生，而紧密连接（TJs）在肠腔和黏膜间起到重要的防御作用［7］。Occludin是一种分子量65 kDa的跨膜蛋白，在与转运过程中，既是结构也是功能蛋白［8］。当Occludin表达减少，非限制性转运通道异常开启，使细菌抗原、毒素等大分子物质异常通过并进入IECs［9］，引起黏膜免疫的调节异常，加重了肠屏障的破坏和功能紊乱［10］。本研究发现，模型组大鼠肠道的Occludin蛋白表达量明显降低，这与目前的主观认识相一致。

该方法建立的UC大鼠模型可出现下利脓血、泄泻、畏寒蜷缩及抱团颤抖等表现，结合症状体征可辨证为寒热错杂证。乌梅丸是寒热错杂证的基础方［11］，美沙拉秦是轻中度UC的常规用药［11］，当采用清肠温中方治疗并对比疗效后发现，清肠温中方能明显减轻疾病程度、降低疾病相关各项评分、促进黏膜修复和上调Occludin表达，其治疗效果与美沙拉秦相当，尤其是对结肠黏膜的修复，效果更是优于乌梅丸。

《灵枢·百病始生》提到“两虚相得，乃客其形”，扶正祛邪是中医治病的重要原则。本文通信作者李军祥教授认为此病病位在肠，与脾胃关系密切。病性为本虚标实、寒热错杂；本虚为脾阳不足，标实为湿热内蕴或夹瘀血；病因病机为外感湿热之邪，或饮食不节，脾胃受伤；或情志不畅，肝气犯脾，日久导致脾胃虚弱，运化失司，水湿内停，湿郁化热，湿热内蕴，而湿热与肠道气血相搏结，气血凝滞，化为脓血。因此，李教授谨守病机，创立了相应治法的清肠温中方。

方中以炮姜、炙甘草温中健脾、培补后天阳气；黄连、苦参、青黛苦寒清热燥湿，同时配伍理气活血药，共奏温中健脾、清热燥湿、调气理血之效。张冰［12］在总结谢晶日教授观点后指出：脾胃虚弱为UC的发病之本，气滞血瘀为标实，因此在治疗上当以扶正为主，这与本文通信作者李教授提出的观点相一致。此外，现代研究显示黄连素及其总生物碱均具有显著的抗溃疡作用［13］；青黛对于难治性UC有明显的疗效并能改善相关症状［14］；苦参总碱能够抑制 NF-κB 的活化，减少炎性因子表达［15］；三七对改善黏液血便尤为显著，能够提高远端UC的临床疗效［16］；此外地榆也具有抗炎及调节免疫等作用［17］。

温中健脾、清热燥湿法正是从脾胃入手，着重培补后天之阳，以苦寒燥湿为辅，兼以调气理血，才能起到治疗UC的功效。后天之本得以巩固，一身之正气方可充沛，营气充实、卫气活跃才能温养肠黏膜浅表的分肉和腠理、抵御外邪，起到了与肠屏障同等重要的防御功能［18］。余秀婷发现黄连素能上调TJs以及抗凋亡蛋白表达，进而修复肠屏障［19］；马家宝指出三七总皂苷可以明显促进Occludin蛋白表达并修复TJs［20］。本研究也发现清肠温中方可以明显增加Occludin蛋白表达，而这可能就是温中健脾、清热燥湿法修复TJs、改善肠屏障，从而发挥治疗UC的潜在机制。

本课题组还发现实验中清肠温中方的不同剂量疗效不同，其中，与临床患者用量相同的中剂量在改善各项指标时效果最突出，这可能分别与高、低剂量引起大鼠的毒副作用或过低刺激无法应答有关，进一步的具体机制我们将在后续开展更为详细的拆方研究。此外，Occludin蛋白表达情况与UC严重程度间存在某种平行升降的关系，下一步我们将通过更深层次的分子生物学和信号通路，展开两者相关性的具体研究，为温中健脾、清热燥湿法在UC中潜在的作用机制和临床应用寻找科学依据。