溃结宁膏穴位敷贴对溃疡性结肠炎（脾肾阳虚证）大鼠Th17/Treg平衡的影响*

王燚霈 朱 莹△ 高 昂

（1.湖南中医药大学第二附属医院，湖南 长沙 410005；2.湖南省长沙市望城区人民医院，湖南 长沙 410200）

溃疡性结肠炎（UC）是一种以结肠黏膜及黏膜下层连续弥漫的溃疡及糜烂为特点的慢性非特异性炎症性肠病，病情易反复，难以治愈，病变持续时间较长，有一定的癌变率［1］，是目前世界公认的难治性疾病。肠道免疫功能紊乱是UC的重要病因。目前研究证明Th17/Treg平衡是肠道免疫功能动态平衡的重要组成部分，其失衡是UC的发病的关键要素［2］。溃结宁膏是本课题组负责人总结治疗UC（脾肾阳虚证）经验而创制的，疗效确切［3-5］。为明确其治疗UC的作用机制，笔者选取UC（脾肾阳虚证）大鼠为观察对象，研究溃结宁膏穴位敷贴对Th17/Treg平衡的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠40只，体质量（200±20）g，由湖南中医药大学实验动物中心提供。动物合格证号：SCXK（湘）2011-0003，SPF实验室许可证编号：SYCK（湘）2013-0005。标准饲料喂养，自由饮用三级过滤纯净水，饲养环境为多层层流架，恒温20～26℃，湿度控制在40%～70%，12 h光照/12 h黑暗，适应性喂养1周后开始实验。

1.2 试药与仪器 1）试药：溃结宁膏由炮附片、细辛、丁香、芥子、赤芍、延胡索、生姜等组成，由湖南中医药大学第二附属医院药剂科提供并制成巴布剂；番泻叶，本院药剂科提供；无药物巴布剂基质由聚丙烯酸钠、明胶、高岭土、甘羟铝、蓖麻油、甘油、聚乙烯醇制成，本院药剂科提供；柳氮磺胺吡啶片，0.25 g/片，上海三维制药有限公司，批号：20120615。 2）试剂及仪器：2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS），美国 Sigma 公司，批号：107K5008；腺嘌呤（Adenine）（购自上海博景化工有限公司），加蒸馏水配置为20g/L混悬液；Foxp3 ELISA试剂盒、IL-17 ELISA试剂盒，武汉基因美生物科技有限公司；台式冷冻离心机，湘仪 TGL-16；全自动酶标洗板机，汇松PW-812；酶标仪，汇松MB-530；电热恒温干燥箱，光都DHG-900Z-0；电子天平，江苏省武进市衡器厂RTZ-IOA-RT；S2-93自动双重纯水蒸馏器，上海亚荣生化仪器厂；AO切片机，LEICA公司RM2235；光学显微镜，OLYMPUS公司BX50。

1.3 分组与造模 健康的SPF级SD雄鼠40只被毛染色法编号、称体质量，按照随机数字表法将40只大鼠分为正常对照组、溃疡性结肠炎（脾肾阳虚证）模型组（模型组）、溃结宁膏穴位敷贴治疗组（敷贴组）、柳氮磺吡啶治疗组（SASP组），每组均为10只。模型组、敷贴组及SASP组大鼠进行动物模型制备。UC（脾肾阳虚证）大鼠模型建立方法参考课题组前期研究［6］。每天上午定时定点，大鼠予腺嘌呤按10 mL/kg剂量灌胃，连续2周，从第3周起开始每日予冰番泻叶按10 mL/kg灌胃，连续2周，造模周期共4周，造模期间自由饮食；每日灌胃0.5 h后用喷雾器给每只大鼠均匀喷4℃冰水50 mL，湿润皮毛，然后将大鼠置于电风扇前（1400 r/min）吹干处置，连续4周后于第29天禁食不禁水24 h，用10%水合氯醛（4 mL/kg）麻醉后，将聚丙烯管插入大鼠肛门上段8 cm处，注入5%TNBS按100 mg/kg（约TNBS原液0.2 mL/100 g）加50%乙醇0.25 mL制成的混合试剂，然后提起大鼠尾部，保持倒置1～2 min，使试剂充分完全在大鼠肠腔渗透，然后将大鼠轻放置于笼子，待其自然清醒，自由饮食饮水。正常对照组大鼠则同期予相应剂量的0.9%氯化钠注射液灌胃和灌肠处理。

1.4 干预方法 所有大鼠均选取以下穴位：中脘、气海、足三里（双侧）、天枢（双侧）。各穴定位参考郭义主编《实验针灸学实验指导》［7］及《大鼠穴位图谱的研制》［8］。中脘：脐上约20 mm左右。气海：脐下约12 mm左右。足三里：在膝关节下侧，腓骨小头下缘5 mm处，左右两侧各一穴。天枢：在脐旁0.5 cm，左右两侧各一穴。敷贴位置先用剪刀将毛剪短，再用剃毛器将毛剃净，每次剃毛4 cm2大小，贴药至穴位处后予鼠夹固定。1）正常对照组：将无药物的巴布剂基质穴位敷贴，0.9%氯化钠注射液［5 mL/（kg·d）］灌胃。 2）模型组：处理同正常对照组。3）敷贴组：溃结宁膏穴位敷贴，0.9%氯化钠注射液［5 mL/（kg·d）］灌胃。 4）SASP 组：无药物的巴布剂基质穴位敷贴，柳氮磺胺吡啶溶液（用0.9%氯化钠注射液配成10 mg/mL的溶液）50 mg/kg剂量灌胃。各组于造模结束后1周开始给药，每日1次，敷贴时间每次1～1.5 h。足三里、天枢每次贴一侧，左右交替，给药疗程均为28 d。

1.5 标本采集与检测 1）一般情况观察。实验期间每天检测并记录各组大鼠体质量、饮食饮水量及肛温作量化指标，观察各组大鼠大便性状、大便次数和血便程度及背毛光泽程度、活动度、精神状态及活动等一般状况。2）疾病活动指数（DAI）评分。实验期间观察大鼠体质量、大便性状、血便情况，按DAI评分标准［9］进行评分，即DAI=（体质量下降指数+大便性状+出血情况）÷3。3）结肠黏膜损伤指数（CMDI）。治疗28 d后大鼠禁食12 h，以10%水合氯醛（4 mL/kg）腹腔注射麻醉，剪开腹壁，快速取结肠组织，肉眼观察结肠病变组织肠黏膜形态，以正常、糜烂、溃疡分级描述，进行结肠黏膜大体形态损伤指数评分［10］。4）结肠组织病理学及组织学损伤指数（TDI）。大鼠脊椎脱臼法处死后，取约1 cm结肠肠段用4%多聚甲醛固定，组织脱水，石蜡包埋，切片机切片，进行常规HE染色，使用光学显微镜观察结肠组织病理变化，进行结肠组织学损伤评分［11］。5）血清及结肠中IL-17、Foxp3水平的测定。取1段长约0.5 cm的结肠组织，冰生理盐水清洗，置于EP管中，采用ELISA法进行测定，严格按照试剂盒说明进行操作。

1.6 统计学处理 应用SPSS21.0统计软件。计量资料以（±s）表示，各组数据先进行正态性分布及方差齐性检验，符合者，组间比较采用单因素方差分析，不符合者采用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组一般情况观察 正常对照组大鼠在整个实验过程中未出现明显的变化，大小便、活动度、精神、饮食饮水量均正常。造模过程中模型组、敷贴组及SASP组大鼠逐渐出现大便溏泄，体毛逐渐枯槁失去光泽，喜扎堆，活动度减少，精神欠佳，频繁眯眼，饮食及饮水量逐渐减少，与正常对照组比较体质量增长缓慢，小便次数增多；造模结束后上述3组大鼠解黏液便，大便隐血阳性，肛门周围沾有污物，拱背蜷缩，喜集聚，体毛枯槁稀疏，精神萎顿，小便清长，饮食及饮水量明显降低，体质量增长幅度较正常组大鼠明显减小，部分甚至出现腹部胀满。经过28 d治疗后SASP组、敷贴组大鼠黏液脓血便、神态萎顿、嗜睡懒动，拱背蜷缩聚堆等症状基本消失，饮食及饮水接近正常对照组，动作较前灵敏，精神好转；模型组大鼠持续解黏液大便，偶可见鲜红色血便，精神持续变差，少气懒动，体毛枯槁脱落，小便量及次数多，饮食及饮水量进一步减少，体质量较前继续下降。

2.2 各组大鼠体质量、饮水及肛温量化比较 见表1。治疗前，与正常对照组对比，模型组、敷贴组及SASP组各组大鼠体质量下降，饮水量明显减少，肛温降低，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），说明脾肾阳虚UC体质量下降，饮水量减少，肛温降低。治疗后，与正常对照组相比，模型组大鼠体质量下降，饮水量下降，肛温降低，差异有统计学意义（P＜0.01），说明疾病持续进展，无明显缓解；与模型组比较，敷贴组、SASP组大鼠体质量、饮水量增加，肛温升高，差异有统计学意义（P＜0.05），提示敷贴、SASP 治疗有效；SASP 组与敷贴组体质量、饮水量、肛温相比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。正常对照组、模型组治疗前后比较差异无统计学意义（P＞0.05）。敷贴组及SASP组治疗后较治疗前体质量、饮水量增加，肛温升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 各组大鼠体质量、饮水量及肛温比较（±s）

表1 各组大鼠体质量、饮水量及肛温比较（±s）

与本组治疗前比较，▼P＜0.05；与模型组治疗后比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与敷贴组治疗后比较，▽P＜0.05，▽▽P＜0.01

体质量（g） 饮水量（mL） 肛温（℃）385.10±25.70▲▲▽▽ 202.50±21.70▲▲▽▽ 37.80±0.16▲▽396.70±26.20▲▲▽ 210.50±22.70▲▲▽ 37.80±0.18▲▲296.40±23.50 120.60±15.50 36.70±0.17（n＝9） 治疗后 276.40±16.50▽ 111.60±14.30▽ 36.50±0.16▽敷贴组 治疗前 300.30±21.50 115.40±16.30 36.80±0.20（n＝9） 治疗后 365.30±22.50▲▼ 188.50±17.80▲▼ 37.60±0.20▲▼SASP 组 治疗前 299.50±20.40 120.40±15.30 37.00±0.19（n＝9） 治疗后 370.50±23.20▲▼ 190.80±16.10▲▼ 37.50±0.18▲▼组 别 时间正常对照组 治疗前（n＝10） 治疗后模型组 治疗前

2.3 各组大鼠DAI、CMDI、TDI比较 见表2。与正常对照组相比，各组大鼠DAI、CMDI及TDI均增高，差异具有显著统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。与模型组相比较，敷贴组及SASP组DAI、CMDI及TDI均显著降低（P＜0.01），但敷贴组、SASP两组间各积分比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组大鼠疾病活动指数、结肠黏膜损伤指数、结肠组织损伤评分比较（分，±s）

与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，▲▲P＜0.01。下同

组 别 n TDI DAI CMDI正常对照组 10 0.82±0.42模型组 9 5.84±1.48**敷贴组 9 2.12±1.06*▲▲0.09±0.18 0.72±0.37 3.00±0.37** 4.61±0.98**1.01±0.29*▲▲ 1.84±0.78*▲▲SASP 组 9 1.87±1.23*▲▲0.91±0.21*▲▲ 1.66±0.74*▲▲

2.4 各组大鼠结肠组织病理观察 见图1。正常对照组：上皮完整，各层结构清晰。模型组：黏膜缺损并且坏死脱落，可见溃疡灶形成，严重者深达黏膜下层，伴中性粒细胞等大量炎性细胞浸润。敷贴组：黏膜缺损较少，黏膜及黏膜下炎性细胞浸润少，腺体结构改善。SASP组：黏膜下毛细血管充血，黏膜下层稍有水肿，少量炎性细胞浸润。

2.5 各组大鼠血清及结肠组织中IL-17和血清中Foxp3水平比较 见表3。与正常对照组比较，模型组、敷贴组、SASP组大鼠血清及结肠中IL-17水平均明显升高、血清Foxp3水平明显降低（P＜0.05或P＜0.01）。与模型组比较，敷贴组及SASP组大鼠血清及结肠组织中IL-17水平明显降低、血清Foxp3水平明显增高（P＜0.01），但敷贴组与SASP组表达差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 大鼠结肠组织病理观察（HE染色，100倍）

表3 各组大鼠血清及结肠组织IL-17、血清Foxp3比较（pg/mL，±s）

表3 各组大鼠血清及结肠组织IL-17、血清Foxp3比较（pg/mL，±s）

组 别 n 血清Foxp3血清IL-17 结肠IL-17正常对照组 10 4650.41±14.00模型组 9 2706.35±6.68**敷贴组 9 3439.17±17.50*▲▲124.09±1.65 93.39±1.76 242.44±10.49**190.83±1.94**174.77±1.61*▲▲ 153.39±2.00*▲▲SASP 组 9 3464.68±12.47*▲▲170.35±4.39*▲▲ 149.00±1.87*▲▲

3 讨 论

UC的发病机制复杂，涉及环境和遗传因素。UC被认为是由于上皮屏障功能受损、肠道菌群失调和异常免疫反应的结果［12］。当前，国内外学者普遍认为肠道免疫在UC的发病中扮演了重要角色［13］。正常状态下，肠黏膜免疫细胞自发分泌抗炎因子与促炎因子，并保持动态平衡，以维持肠道的正常免疫，当机体受到刺激时，该平衡被打破，炎性因子的分泌失衡，抗炎因子降低，促炎因子升高，导致肠黏膜免疫失衡［14］。Th17与Treg是一对具有相互拮抗作用的T淋巴细胞，维持着肠道免疫稳态平衡，当肠道出现异常时常表现出Th17/Treg失衡，引起一系列炎症反应损伤肠道组织。Th17 细胞主要分泌 IL-17、IL-6、IL-21、IL-22、TNF-α等细胞因子，在UC中起促炎性作用［15］。Treg细胞主要以表达转录因子Foxp3为特征，它具有免疫抑制功能，能控制肠道炎症。近年来有研究表明Th17/Treg平衡向Th17方向倾斜时UC发生发展，当Th17/Treg平衡像Treg方向倾斜时，UC可缓解。

中医学溃疡性结肠炎可归属于 “痢疾”“泄泻”“肠癖”“大瘕泄”等范畴。本文第2作者朱莹在近10年的前期研究发现大多数UC患者表现为脾肾阳虚的症状为主，实为病延日久，损伤肾阳，肾阳不足，命门火衰，不能温煦脾土，阳气不能温煦，血行不畅，又“久病必瘀”，而导致气血瘀滞，故提出UC的病机以“脾肾阳虚挟瘀”为主，并本着“治病求其本”的原则，创制出溃结宁膏，方中以炮附子、细辛、丁香、延胡索、赤芍、生姜、白芥子等作为主要成分，选取敷贴穴位：胃经的募穴“中脘”、大肠经的下合穴“足三里”及募穴“天枢”、补肾固元的“气海”。现代腧穴学研究表明，足三里、气海能增强机体免疫力，与天枢、足三里相配能改善肠道微循环，从而消除炎症，修复损伤的肠黏膜屏障。溃结宁膏经皮肤、穴位持续作用于全身，达到对UC的治疗作用。课题组前期临床研究证实溃结宁膏穴位贴敷治疗UC具有较好的临床疗效，其机制可能与抑制自身免疫性炎症机制相关［4-5，16，19］。

本实验观察到改善大鼠一般临床表现方面，各组采取相应治疗措施治疗后，敷贴组及SASP组大鼠较模型组体质量、饮水量增长，肛温升高，提示溃结宁膏穴位敷贴可有效改善UC（脾肾阳虚证）大鼠临床症状。肠道炎症方面，与正常组相比，模型组DAI、CMDI、TDI均明显增高，说明UC（脾肾阳虚证）大鼠出现便溏、大便隐血阳性、体质量减轻、结肠组织出现糜烂甚至溃疡，炎性细胞的浸润十分明显；与模型组比较，敷贴组及SASP组DAI、CMDI、TDI均显著下降，说明溃结宁膏穴位敷贴及SASP灌胃可以改善UC（脾肾阳虚证）大鼠便血情况，加快体质量增长，促进黏膜愈合，减少中性粒细胞的浸润，溃结宁膏穴位敷贴可改善肠黏膜炎症。炎性因子方面，采用ELISA对血清及结肠组织中IL-17、Foxp3表达进行检测，与正常组对比，模型组大鼠血清及结肠组织中IL-17的表达明显增高，Foxp3水平明显下降，与模型组比较，敷贴组及SASP组大鼠IL-17水平明显降低、Foxp3水平明显增高，说明溃结宁膏穴位敷贴及SASP灌胃可明显降低UC（脾肾阳虚证）大鼠血清及结肠组织中炎性因子IL-17的水平，并能增高抑炎转录因子Foxp3的水平，减少肠道炎症反应。

综上所述，UC（脾肾阳虚证）发病与IL-17水平增高、Foxp3水平降低呈相关性，而溃结宁膏穴位敷贴可明显改善UC（脾肾阳虚证）大鼠一般临床表现，显著降低促炎因子IL-17表达、增高抗炎因子Foxp3表达，调节Th17/Treg的平衡，维持肠道黏膜免疫功能平衡，从而有效地治疗UC（脾肾阳虚证）。