电针预处理对急性心肌梗死无复流大鼠心肌自噬与凋亡相关蛋白表达的影响*

陈 晨 曹明明 吴 丹 吕晓琳 冯秋菊 黄树明△

（1.黑龙江中医药大学附属第二医院，哈尔滨 黑龙江 150001；2.黑龙江中医药大学，哈尔滨黑龙江 150040）

无复流现象是急性心肌梗死再灌注治疗的严重并发症之一，直接影响着患者的预后。有研究调查发现，在对ST段抬高的急性心肌梗死患者行PCI治疗后，冠状动脉无复流的发生率高达32%［1-2］。因此，有效防治再灌注无复流的发生，能够显著降低患者心力衰竭和住院死亡的发生。然而本病病理机制复杂，目前尚无有效的防治无复流的方法。针灸作为一种安全、有效、便捷的治疗手段，已被广泛用急重症的治疗。大量研究证实，针刺能够通过自噬途径改善组织形态，从而促进细胞胞存活发挥保护效应。本课题组前期在针刺防治缺血再灌注损伤和无复流方面均做了大量的研究，结果显示电针预处理能够通过调控再灌注心肌炎性因子的表达，从而减少无复流现象的发生。因此本研究通过观察心肌细胞自噬和凋亡相关蛋白的表达，旨在进一步阐明电针防治急性心肌梗死无复流的作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级SD大鼠40只，雄性，9周龄，体质量（250±16）g，由黑龙江中医药大学动物实验中心提供，动物合格证批号：SCXK（黑）2015003。饲养条件：室温20～23℃，湿度45%～50%，普通饮食，自由饮水。实验过程符合《实验动物管理和使用指南》［3］中的相关规定。

1.2 试药与仪器 1）试药：阿托伐他汀钙片（立普妥，国药准字H20051408，辉瑞制药有限公司，20 mg/片），6%硫磺素、伊文思兰和2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色（TTC）试剂盒（美国 Sigma公司），一抗：兔抗大鼠Beclin1、LC3、p62/SQSTM1、Bcl-2、Bax 和 β-actin 多克隆抗体（万类生物科技有限公司）。二抗：HRP标记的山羊抗兔IGG抗体（碧云天生物科技有限公司）。2）仪器：25 mm×40 mm针灸针 （贵州安迪药械有限公司），SDZ-Ⅱ电子针疗仪（苏州医疗用品厂有限公司），Premium U570-80℃超低温冰箱 （德国Eppendorf公司），DYCZ-24K电泳仪、DYCZ-24EN电泳槽 （北京六一生物科技公司）。

1.3 分组与造模 大鼠按照随机数字表法分为假手术组、模型组、电针预处理组和阿托伐他汀组，每组10只。除假手术组外，其余组大鼠均参照韦星等［4］造模方法，大鼠20%乌拉坦腹腔注射麻醉后固定于实验台，气管切开，插管连接呼吸机并调整呼吸参数。沿胸骨左缘第2肋至第4肋纵行切开，打开心包膜，剔除心底的脂肪组织后于左心耳和肺动脉圆锥出结扎冠状动脉左前降支，假手术组不做结扎处理。结扎处理45 min后剪断结扎线以恢复血供，根据心肌颜色的变化证实再灌注，再灌注时间为120 min。

1.4 干预方法 电针预处理组固定大鼠后，针灸针垂直刺入双侧“内关穴”“心俞穴”和“膻中穴”分别采用斜刺法和平刺法。“内关穴”（双侧）“心俞穴”（双侧）及“膻中穴”（单侧），参照《实验针灸学》［5］中相关穴位的定位。进针后行提插捻转手法行针1 min后连接SDZ-Ⅱ电子针疗仪。连接方法：同侧穴位以内关穴连接心俞穴，膻中穴在其旁开0.5 cm处另刺入一针作为辅助电极，疏密波，频率5 Hz，强度1 mA，以上肢轻微震颤为度，每日治疗1次，每次30 min，连续治疗7 d。阿托伐他汀组于造模前给予阿托伐他汀钙片15 mg/kg与2 mL 0.9%氯化钠注射液配制成悬浊液，灌胃治疗，每日1次，连续治疗7 d。模型组和假手术组给予等体积的0.9%氯化钠注射液灌胃治疗。

1.5 标本采集及检测 1）样本采集及缺血率、心肌无复流率、梗死率监测。再灌注结束后于左心房注入0.4 mL的6%硫磺素后，结扎冠状动脉左前降支，于左心房再次注入0.4 mL的2%伊文思兰。迅速处死大鼠后取出心脏，放入生理盐水中冲洗心脏，放入-80℃冰箱中冷冻10 min。取出心脏，沿长轴方向将心室切成厚度约为2 mm的切片，在365 nm的紫外线下观察硫黄素染色，在普通光照下观察伊文思兰染色。无复流区在荧光下不显色，复流区显色；非缺血区心肌呈蓝色，缺血区不着蓝色。然后将心脏切除置于TTC中进行染色，梗死区呈灰白色，非梗死区呈红色。分别计算缺血率（缺血率=缺血面积÷左室室壁心肌面积），心肌无复流率（无复流率=无复流面积÷缺血面积）和梗死率 （梗死率=梗死面积÷缺血面积）。2）自噬和凋亡相关蛋白的检测。取大鼠心室缺血区心肌组织液氮研碎，加入RIPA裂解液后均浆，13000 r/min离心15 min，BCA法检测上清液蛋白浓度。SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜上，室温封闭1.5 h后加入相应一抗（1∶500稀释），4℃孵育过夜，TBST清洗3次，加入HRP标记的二抗 （1∶500稀释），室温孵育1.5 h，TBST清洗3次。ECL发光液显色，扫描，Quantity One软件分析，βactin作为内参，比值结果表示蛋白相对含量。

1.6 统计学处理 应用SPSS20.0统计软件。计量资料以（±s）表示，在符合正态分布的情况下，多组间的比较采用ANOVA单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠缺血和无复流范围的比较 见表1。硫黄素染色结果显示，除假手术组外，各组心室缺血率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；伊文思兰及TTC染色结果显示，电针预处理组无复流和心肌梗死面积较模型组显著减少（P＜0.01）。

表1 各组大鼠缺血和无复流范围比较（%，±s）

表1 各组大鼠缺血和无复流范围比较（%，±s）

与假手术组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。下同

组 别 n 梗死率缺血率 无复流率假手术组 10 0模型组 10 40.62±4.11电针预处理组 10 19.76±3.05**0 0 49.30±3.76 21.52±4.07 47.44±5.09 11.78±2.18**阿托伐他汀组 10 26.35±3.62**50.75±4.21 18.20±2.74**

2.2 各组大鼠心肌组织自噬相关蛋白的表达 见表2，图 1。 造模后，大鼠心肌组织中 Beclin1、LC3Ⅱ、p62/SQSTM1蛋白表达显著增高，LC3Ⅰ蛋白表达显著降低，与假手术组比较，差异具有统计学意义（P＜0.01）；电针预处理能够显著降低再灌注大鼠心肌组织中Beclin1、LC3Ⅱ、p62/SQSTM1 蛋白的表达，增加 LC3Ⅰ蛋白的表达，与模型组比较，差异有统计学意义 （P＜0.01）。此外，造模后大鼠LC3Ⅰ/LC3Ⅱ比值显著增高，电针预处理能够显著调控心肌组织中LC3Ⅰ、LC3Ⅱ的比例，差异具有显著统计学意义（P＜0.01）。

表2 各组大鼠心肌组织自噬蛋白表达比较（%，±s）

表2 各组大鼠心肌组织自噬蛋白表达比较（%，±s）

组 别 n Beclin1/β-actin LC3Ⅰ/β-actin LC3Ⅱ/β-actin LC3Ⅱ/LC3Ⅰ p62/SQSTM1/β-actin假手术组 10模型组 10电针预处理组 10 0.85±0.09 1.14±0.22 0.40±0.10 1.78±0.39△△ 0.55±0.10△△ 1.70±0.33△△0.83±0.23** 1.35±0.47** 0.44±0.07**0.36±0.13 0.36±0.05 3.18±0.95△△ 1.17±0.12△△0.36±0.12** 0.30±0.09△△阿托伐他汀组 100.94±0.24** 1.10±0.47** 0.67±0.09**0.85±0.80** 0.45±0.07△△

图1 各组大鼠心肌组织自噬蛋白表达的比较

2.3 各组大鼠心肌组织凋亡相关蛋白的表达 见表3，图2。造模后，大鼠心肌组织中Bcl-2、Bax蛋白表达显著增高，与假手术组比较，差异具有统计学意义（P＜0.01）；电针预处理能够显著增加再灌注大鼠心肌组织中Bcl-2蛋白的表达，降低Bax蛋白的表达，与模型组比较，差异具有统计学意义（P＜0.01）。此外，造模后大鼠Bcl-2/Bax比值显著降低，电针预处理能够显著升高心肌组织中Bcl-2/Bax的比例，差异具有统计学意义（P＜0.01）。

图2 各组大鼠心肌组织凋亡蛋白表达的比较

表3 各组大鼠心肌组织凋亡蛋白表达比较（%，±s）

表3 各组大鼠心肌组织凋亡蛋白表达比较（%，±s）

组 别 n Bcl-2/Bax Bcl-2/β-actin Bax/β-actin假手术组 10 1.58±0.63模型组 10 0.83±0.22△△电针预处理组 10 3.67±0.72**0.52±0.09 0.37±0.11 0.78±0.10△△ 0.99±0.25△△1.68±0.14** 0.48±0.12**阿托伐他汀组 10 2.38±0.71**1.45±0.30** 0.63±0.11**

3 结 果

无复流现象首次由Krug等于1966年在犬冠状动脉实验中观察到，1974年Kloner等再次在犬冠状动脉实验模型中观察到无复流现象的出现，并首次对其进行了定义。无复流现象是一个多因素相互交错的病理过程，其中远端微循环血管的机械栓塞、损伤的内皮细胞诱导的微血管痉挛、缺血心肌中性粒细胞的聚集引起的血液黏稠和炎症介质的组织、细胞水肿均能显著增加急性心肌梗死后无复流现象的出现［6］。

自噬是广泛存在于真核细胞内的一种溶酶体依赖性降解途径，主要负责降解大量蛋白和细胞器，是一种高度保守的生理机制［7-8］。自噬的过程非常复杂，缺血、缺氧、钙浓度的增加和氧化应激反应均能诱导细胞内自噬的产生，同时自噬能减少凋亡因子进入细胞质，在维持心肌细胞功能、功能和内环境稳态方面具有重要的作用［9-10］。赵海洋等通过研究发现，自噬在急性心肌梗死大鼠无复流区心肌组织中表达增强，且自噬与无复流的发展和程度密切相关［11］。Beclin1是酵母Atg6/Vps30基因在哺乳动物中的同源物，参与自噬体膜的形成，能够上调诱导自噬的发生，是自噬关键调控蛋白之一［12］。微管相关蛋白 1 轻链 3（LC3）是经典的自噬前体，LC3最先生无自噬活性成胞浆型LC3I，进一步转化成具有自噬活性的膜型LC3Ⅱ，并定位于溶酶体膜和自噬体上，能够间接反映溶酶体和自噬体的数量［13］。研究证实自噬发生后，细胞内的LC3Ⅰ表达下降，LC3Ⅱ表达及 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值迅速增加［14-15］。p62/SQSTM1作为一种支架蛋白，能够通过C端的泛素结构域与LC3相互结合，将募集的分子的聚集于自噬体，并与溶酶体融合成自噬溶酶体后被降解［16］。当自噬活性减弱后，能够造成细胞质中p62蛋白的积累，因此p62蛋白的检测能够间接反映单元自噬小体的清除程度［17］。

凋亡途径分为外源性途径和内源性途径，由Bcl-2组成的线粒体途径是缺血心肌细胞凋亡的重要途径之一［18］。Bcl-2作为重要的抗凋亡蛋白，能够抑制线粒体通透转换孔的开放，从而抑制细胞的凋亡，Bax作为促凋亡蛋白之一，作用与Bcl-2相反，且能够通过多种途径激活凋亡途径，因此Bcl-2/Bax的比值更加能够体现二者对细胞凋亡的实际调控作用［19］。研究发现，再灌注能够调控急性心肌梗死后心肌细胞中Bcl-2、Bax蛋白的表达，从而减少梗死周边缺血区心肌细胞凋亡［20］。

他汀类药物能够通过抑制胆固醇合成的限速酶，从而降低血清脂蛋白和胆固醇，延迟缺氧诱导的心肌细胞的死亡，减轻心肌再灌注诱发的损伤，改善心功能，在防治心血管疾病方面越来越受到重视［21］。高俊甲研究发现，阿托伐他汀预处理可有效改善再灌注大鼠的血流动力学紊乱，改善无复流现象，从而减少心肌梗死的面积［22］。中医学不仅能够从多靶点、多层面改善再灌注后无复流现象，减少恶性事件的发生，还能能够最大程度地改善患者的生存质量，降低死亡率［23］。本研究首次采用电针预处理防治再灌注无复流，研究结果显示：电针能够显著降低再灌注大鼠心肌组织中Beclin1、LC3Ⅱ、p62/SQSTM1蛋白的表达，增加LC3Ⅰ蛋白的表达，调控LC3Ⅰ与LC3Ⅱ之间的转换；另一方面，电针能够显著增加再灌注大鼠心肌组织中Bcl-2蛋白的表达，降低Bax蛋白的表达，从而升高心肌组织中Bcl-2/Bax的比例，改善无复流现象的出现，减少心肌梗死的面积。

综上所述，电针预处理能够改善急性心肌梗死再灌注无复流现象，减少心肌梗死的面积，其作用机制可能是通过调控心肌细胞自噬和凋亡水平实现的。