住院患儿临床分离碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌分子流行病学特征

邹翠美， 马瑞林， 胡付品， 朱泳璋， 任 峥

近年来，碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌（CRKP）的检出率上升明显[1-3]，引起医疗卫生领域的高度关注。由于不同地区CRKP产生的碳青霉烯酶类型不同，可能与各地区使用抗菌药物种类不同有关[4]，特别是儿童疾病中以感染性疾病居多，是抗菌药物应用最多的群体，儿童患者由于免疫力较低更容易感染CRKP[5]。因此，研究银川市第一人民医院（我院）内儿童患儿中CRKP的分子流行特征，对遏制其流行播散有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细菌 收集我院2014－2016年所有新生儿病区（NICU）和普通儿科病房患者CRKP菌株共16株，剔除同一患者分离的重复菌株。

1.1.2 培养基及抗菌药物 哥伦比亚琼脂和Mueller-Hinton琼脂购自英国OXOID公司，常规使用自动化仪器法和纸片扩散法进行药敏试验，药敏纸片购自英国OXOID公司，复核使用的亚胺培南E试验条和美罗培南E试验条为英国OXOID公司的微生物药敏试纸。

1.2 方法

1.2.1 细菌鉴定和药敏试验 细菌鉴定药敏试验采用BD公司的phoenix 100全自动鉴定药敏系统及其配套试剂。参照2016年CLSI推荐的微量肉汤稀释法测定16株菌对抗菌药物敏感性，结果判读按照CLSI 2016年折点标准。药敏试验质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922，来自卫计委临床检验中心。

1.2.2 碳青霉烯酶表型及基因型检测 3'-氨基苯硼酸（APB）和乙二胺四乙酸（EDTA）协同试验表型检测肺炎克雷伯菌中的碳青霉烯酶。含EDTA或APB厄他培南与单厄他培南抑菌圈直径相差≥5 mm提示产金属酶或KPC型碳青霉烯酶。PCR法扩增碳青霉烯酶（KPC、 NDM、IPM、VIM）、AmpC酶（MOX、CIT、DHA、ACC、EBC、FOX ）、超广谱β内酰胺酶（ESBL）（CTX-M、OXA）和TEM型β内酰胺酶基因，所用引物参考相应文献[6-8]。PCR阳性产物经DNA测序并分析具体基因型别。

1.2.3 接合试验 选用对利福平耐药的大肠埃希菌EC600作为受体菌，CRKP作为供体菌进行质粒接合试验。供体菌和受体菌分别在MH肉汤中培养后，按照1∶1混合后加入新鲜的MH肉汤中，静置 35 ℃孵育18～20 h，取100 µL混合液涂布在含600 mg/L利福平和25 mg/ L氨苄西林的MH筛选平皿上孵育18～24 h，在含药平皿上挑取单个菌落接种到CHROMagar显色平皿上判断是否为接合子，对接合子进行目的基因PCR 扩增及药敏试验。

1.2.4 脉冲场凝胶电泳（PFGE） 采用PFGE对16株CRKP进行同源性分析，菌株经Xba I酶切后包埋于1%琼脂糖凝胶中，在无硫脲的含0.5×Tris-硼酸（TBE）缓冲液中进行PFGE，沙门菌H9812为参考菌株。酶切图谱按照美国CDC TENOVER等推荐的方法判读[9]。

1.2.5 数据分析 采用WHONET 5.6软件进行数据分析。

2 结果

2.1 细菌

16株CRKP中，13株分离自新生儿患者，3株分离自普通儿科患者，年龄范围2 d～3个月。4株来自血标本、11株来自痰标本、1株来自气管导管末端标本。

2.2 药敏试验

16株CRKP对多黏菌素E、阿米卡星、环丙沙星100%敏感，对头孢菌素类、碳青霉烯类药物100%耐药，对哌拉西林-他唑巴坦11.1%敏感。基因测序结果显示，6株金属β内酰胺酶基因阳性，包括2株blaNDM-16、2株blaIPM-34和2株blaIPM-4，其余10株均未检出碳青霉烯酶基因，而检出blaCTX-M（CTX-M-65、CTX-M-3、CTX-M-15）和AmpC酶（DHA-1）的耐药基因。见表1。

2.3 CRKP耐药基因水平传播及分子流行病学

接合试验：将未检出碳青霉烯酶B类金属酶的CRKP抽取2株做供体菌，与受体菌EC600接合，接合后经PFGE证实，EC600获得耐药质粒，其药敏结果也与供体菌一致。

2.4 临床信息

入院患儿分布：13例新生儿病例中早产儿7例，窒息3例，肺炎1例，先天性心脏病1例，发热待查1例；3例普儿科患儿中2例重症肺炎，1例支气管炎。抗菌药物使用情况，普儿科、NICU基本

首选头孢他啶、头孢呋辛、阿莫西林-克拉维酸、青霉素；严重感染患儿或是检出CRKP则使用美罗培南，未使用过其他类抗菌药物，其中1例先天性心脏病患儿痰分离出CRKP未使用抗菌药物。患儿转归情况，16例患儿14例好转出院，2例放弃治疗出院。16例患儿临床信息见表2。

表1 16株CRKP基因型及对常用抗菌药物的药敏试验结果Table 1 MICs of selected antimicrobial agents against 16 carbapenem-resistant K. pneumoniae strains and the corresponding genotype（mg/L）

表2 16例患儿临床信息Table 2 Clinical data of 16 pediatric patients

2.5 同源性分析

PFGE显示，16株CRKP共发现6个克隆株，其中 A 型5株、C 型4株、B 型3株、D型2株、E型和F型各1株。部分菌株PFGE结果见图1。

3 讨论

根据我院常规细菌耐药性监测数据显示 ，儿科送检的微生物标本占全院微生物标本的一半以上，碳青霉烯类耐药的肠杆菌科细菌中肺炎克雷伯菌最多见，主要集中在儿科病房[10]。2014年以前我院儿科病房未检出CRKP。2014年5月首先在NICU中10 d内3例患儿血液中相继检出CRKP，2015年12月在NICU前后半个月2例患儿痰培养检出CRKP，2016年上半年NICU每月报告1例或2例患儿痰培养检出CRKP。普儿科仅在2016年2月第1次报告，一对双胞胎痰培养中同时检出CRKP，同年4月报告1例患儿痰培养检出CRKP。普儿科3例患儿均是在入院当日送检痰培养后检出CRKP。NICU的13例CRKP中仅有38.5%（5/13）是入院48 h内检出，61.5%（8/13）是入院48 h以后检出，其中8例来源于痰，4例来源于静脉血，1例来源于气管导管末端。

图1 部分菌株PFGE同源性分析图Figure 1 Pulsed-field gel elelectrophoresis patterns of 8 carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae isolates

药敏结果显示，与国内报道相同的是未发现对多黏菌素耐药菌株，不同的是CRKP对环丙沙星、阿米卡星的高敏感性，对β内酰胺类及酶抑制剂复方制剂和碳青霉烯类药物未见敏感菌株[11]。

目前，碳青霉烯类抗生素因具有抗菌谱广、抗菌活性强的特点，是治疗多重耐药肠杆菌科细菌感染的最后一道防线。不同地区CRKP产生的碳青霉烯酶类型不同，国内外报道最多的碳青霉烯酶是KPC基因型，儿童患者产金属酶如IMP-4基因型较多见，NDM型偶有报道[11-12]，本研究收集2014－2016年儿童患者分离的16株CRKP中，未检出KPC酶，只检出6株产金属酶，其他10株CRKP菌株金属酶检测表型试验阳性但基因型检测为阴性，抽取2株菌2007和2119做接合试验，与大肠埃希菌EC600接合成功，证明碳青霉烯酶耐药基因位于可移动质粒或基因元件上，存在着传播风险，但未检测到耐药基因，推测是否可能是某种金属酶的变异体或新型金属碳青霉烯酶导致细菌耐药，今后需进一步研究。

根据PFGE的结果分析，CRKP在新生儿科的为A 型、C 型、B型，普儿科为D型；新生儿菌株1973、2007、2106、1918具有同源性，提示CRKP在NICU内有流行，要着重监控CRKP病例，需引起感染科和医护人员的高度重视，及时采取隔离措施，防止医院感染暴发。