8株携带blaNDM-1基因阴沟肠杆菌耐药性研究

文江雄， 刘 洋， 邬小萍， 张 伟， 程 娜， 向天新

阴沟肠杆菌是临床常见的医院感染病原菌，可引起包括泌尿道、皮肤和软组织、呼吸道、中枢神经系统等各种感染，并也可在新生儿病房流行[1]。碳青霉烯类抗生素是治疗产 ESBL细菌所致感染的重要抗生素。但随着临床上碳青霉烯类抗生素广泛使用，导致对该类抗生素耐药的菌株日益增多，耐碳青霉烯类抗生素的阴沟肠杆菌也频见报道，其耐药机制主要是细菌产碳青霉烯酶[2]。碳青霉烯酶是指对亚胺培南、美罗培南和厄他培南等碳青霉稀类抗生素具有水解能力的一类酶。目前已发现该类酶的种类已多达数十种，主要有Ambler分子分类中的A、B、D类酶[3]。NDM酶属于Ambler分类中的B类酶，是近年发现的金属β内酰胺酶。该酶发现于耐多药的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌。研究发现其耐药性由一种金属酶引起，并将该酶命名为NDM-1[4]。NDM的表型及基因型向多样性发展，也有其他亚型发现，目前阴沟肠杆菌中只有NDM-1一种亚型被发现，但是产碳青霉烯酶的阴沟肠杆菌已经是造成临床重症感染的菌株之一。南昌大学第一附属医院于2016年1月－2017年6月分离的阴沟肠杆菌中筛出145株对碳青霉烯类抗生素不敏感的阴沟肠杆菌。对这些阴沟肠杆菌的耐药现状及其对碳青霉烯类耐药的主要机制进行了实验室研究，发现8株阴沟肠杆菌携带blaNDM-1基因，现对其研究结果报道如 下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 收集 2016 年 1 月－ 2017 年 6月我院各临床标本分离的501株阴沟肠杆菌，从中筛出 145 株对碳青霉烯类抗生素不敏感的阴沟肠杆菌（亚胺培南或美罗培南MIC≥2 mg/L，剔除重复菌株）作为实验菌株，所有受试菌株均由法国生物梅里埃 VITEK 2-Compact 全自动微生物分析仪进行鉴定和药敏试验。药敏试验结果按2017年CLSI折点 统计分析耐药率和敏感率[5]。对所有患者临床资料调查分析发现，均无国外旅游史。质控菌株为大肠埃希菌 ATCC 25922和肺炎克雷伯菌ATCC 700603。

1.1.2 仪器和试剂 DNA Marker购自大连TaKaRa公司；2xTaq PCR Master Mix酶， Ex Taq DNA聚合酶均购自Vazyme公司；美罗培南（10 μg/纸片，英国 OXOID 公司），亚胺培南（美国Amresco公司），胰蛋白胨大豆肉汤（ trypticase soy broth，TSB） 培养基购自温州康泰生物公司；琼脂糖购自上海生工生物技术有限公司；VITEK 2-Compact全自动微生物鉴定仪购自法国生物梅里埃公司；PCR仪购自德国Eppendorf公司；电泳仪购自美国Bio-Rad公司；凝胶成像仪购自北京六一公司，相关扩增引物参照有关文献，由上海生工生物技术有限公司合成。

1.2 实验方法

1.2.1 碳青霉烯酶blaNDM-1等基因检测 145株对碳青霉烯类抗生素不敏感阴沟肠杆菌采用煮沸法提取DNA，按照表1的NDM-1引物和条件进行blaNDM-1基因扩增。获取的blaNDM-1阳性菌株根据表1引物及实验条件进行blaKPC、blaVIM、blaIMP、

blaOXA-48、blaSPM、blaGIM碳青霉烯酶基因检测。参照文献 [6]条件进行PCR扩增，50 μL扩增体系为2xTaq PCR Master Mix：25 μL，上游引物：2 μL，下游引物：2 μL，模板：2 μL，ddH2O：19 μL；PCR的反应条件：95 ℃预变性5 min，后95 ℃变性30 s，60 ℃退火复性30 s，72 ℃延伸1 min，进行30个循环，最后72 ℃延伸10 min；扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检验，将阳性条带的PCR扩增产物送苏州鸿讯生物科技有限公司进行测序，测序结果与美国生物信息中心（the National Center for Biotechnology Information，NCBI）BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行分析，判断结果是否准确。

1.2.2blaNDM-1阳性菌株改良碳青霉烯灭活试验（modified carbapenem inactivation method，mCIM） mCIM是一种改良的碳青霉烯酶表型检测试验[7]，取1 μL接种环过夜培养的纯菌落于2 mL TSB肉汤中，振荡10 s，将含10 μg美罗培南的无菌纸片浸没于TSB菌液中，35 ℃孵育4 h。孵育结束时，将0.9% NaCl溶液制备的0.5麦氏浊度的大肠埃细菌ATCC 25922菌悬液涂布于MH琼脂平皿上室温放置3～10 min，将美罗培南纸片从TSB菌液中取出，将纸片贴于涂布有大肠埃希菌ATCC 25922的MH琼脂平皿上，35 ℃过夜培养。若抑菌圈直径≤18 mm，则mCIM阳性，即待测菌株产碳青霉烯酶；若抑菌圈直径≥19 mm，则不能确定是否产碳青霉烯酶。

1.2.3blaNDM-1阴沟肠杆菌对抗菌药物的敏感性测定 筛选到的对碳青霉烯类抗生素耐药的blaNDM-1阳性的阴沟肠杆菌采用VITEK 2-Compact 全自动微生物分析系统进行菌种的再次确认和药物敏感性试验，药敏结果参照2017年CLSI推荐的折点进行判读。

1.2.4blaNDM-1阳性菌株肠杆菌基因重复一致序列（ERIC）-PCR分析 使用ERIC-PCR对受试菌进行同源性分析。采用煮沸法提取细菌的DNA作为模板。ERIC-PCR引物序列ERIC：5'-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3'[8]。反应体系：10×buffer 5 μL，dNTP 4 μL，Ex Taq DNA聚合酶1 μL，ERIC引物2 μL，双蒸水37 μL。反应条件：95 ℃ 5 min变性；94 ℃ 1 min、26 ℃1 min、72 ℃ 2 min，4个循环；随后94 ℃ 30 s、40 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，40个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳40 min后鉴定。结果判断：同源性菌株扩增条带位置完全相同则具有同一ERIC基因指纹图谱；主条带位置相同，副条带相差1～2条者则为亚型；不符合上述条件者则具有不同ERIC-基因指纹图谱型，判定为非同源性菌株[9]。 所用引物见表1。

表1 PCR引物序列及扩增片段Table 1 The PCR primer sequences and the amplilied fragments

2 结果

2.1 阴沟肠杆菌碳青霉烯酶blaNDM-1等基因的检测

2016年1月－2017年6月分离收集的501株阴沟肠杆菌对各类抗菌药物的敏感性试验结果显示于表2。根据亚胺培南或美罗培南MIC≥2 mg/L，筛选出145株对碳青霉烯类抗生素不敏感的阴沟肠杆菌。经blaNDM-1基因PCR扩增确认，结果发现有8株细菌携带blaNDM-1基因，阳性检测率为5.5%。.

8株blaNDM-1基因阳性的阴沟肠杆菌分离自7例患者，患者分布于6个临床科室；4株分离于4例患者的清洁中段尿，2株分离于2例患者的痰液标本，1株分离于患者粪便标本，1株分离于患者脑脊液（术后）标本。其中1例患者从清洁中段尿和痰液标本中同时分离出阴沟肠杆菌YG5和YG6。

表2 2016年1月－2017年6月检出阴沟肠杆菌药敏结果Table 2 Susceptibility of the Enterobacter cloacae strains during the period from January 2016 to June 2017（%）

8株blaNDM-1基因检测阳性的阴沟肠杆菌PCR电泳结果见图1，8株细菌均有明显的blaNDM-1基因扩增阳性条带。其扩增产物经苏州鸿讯生物科技有限公司测序验证皆为blaNDM-1基因。

图1 blaNDM-1基因阳性阴沟肠杆菌PCR电泳结果Figure 1 Electrophoretic results after PCR amplification of blaNDM-1 gene in 8 Enterobacter cloacae strains

随后对这8株blaNDM-1基因阳性的阴沟肠杆菌进行blaKPC、blaVIM、blaIMP、blaOXA-48、blaSPM、blaGIM基因检测未发现其同时携带其他碳青霉烯酶耐药基因。

2.2 blaNDM-1阳性菌株mCIM碳青霉烯酶表型试验

8株blaNDM-1基因阳性阴沟肠杆菌进行mCIM，结果显示美罗培南的抑菌圈皆小于18 mm，mCIM全部阳性。见图2。

2.3 blaNDM-1阳性阴沟肠杆菌对抗菌药物的敏感性

采用VITEK 2-Compact 全自动微生物分析系统进行菌株体外药物敏感性试验。结果见表3。8株blaNDM-1阳性阴沟肠杆菌对碳青霉烯类、头孢菌素类和青霉素类等抗生素普遍耐药，但个别菌株 对四环素和阿米卡星敏感。

图2 blaNDM-1阳性菌株碳青霉烯酶表型结果图Figure 2 Phenotypic testing of carbapenemases in blaNDM-1 positive strain

表3 8株blaNDM-1阳性阴沟肠杆菌的药敏试验结果Table 3 MICs of various antimicrobial agents against 8 strains of blaNDM-1-positive Enterobacter cloacae（mg/L）

2.4 blaNDM-1阳性菌株ERIC-PCR同源性分析结果

ERIC-PCR电泳结果将8株blaNDM-1基因阳性阴沟肠杆菌大致分为4种不同类别的指纹图谱（A～D），A型3株（YG4、YG7和YG8）；B型（YG1与YG2）和C型（YG5与YG6）各为2株；D型只有1株YG3。ERIC-PCR电泳结果见图3。

图3 8株blaNDM-1阳性阴沟肠杆菌的ERIC-PCR结果Figure 3 ERIC-PCR typing results of 8 strains of blaNDM-1-positive Enterobacter cloacae

3 讨论

随着抗生素的广泛使用，造成的细菌耐药问题已经引起了全球学者的高度关注，尤其是碳青霉烯类抗生素监管不力及不合理应用所造成的革兰阴性杆菌的耐药现象已经越来越普遍。阴沟肠杆菌是造成临床感染的常见革兰阴性杆菌之一，现今临床上产碳青霉烯酶的阴沟肠杆菌也日益增多，其引起的感染多为难治性的重症感染[12-13]。本研究在我院145株对碳青霉烯类抗生素不敏感的阴沟肠杆菌中检出8株携带blaNDM-1基因，blaNDM-1基因阳性率为5.5%（8/145），未发现其同时携带blaKPC、blaVIM、blaIMP、blaOXA-48、blaSPM、blaGIM碳青霉烯酶耐药基因。这是江西省近年发现携带blaNDM-1基因阴沟肠杆菌最多的一次，虽然该类菌株未造成严重的感染性事件，但是携带blaNDM-1基因产生的碳青霉烯酶造成以碳青霉烯类抗生素耐药为主的多重耐药问题给临床带来了很大的治疗困难。

8株blaNDM-1基因阳性阴沟肠杆菌的药敏结果显示均为多重耐药菌株，尤其对碳青霉烯类、头孢菌素类和青霉素类抗生素的耐药率非常高，对四环素和阿米卡星的耐药率相对较低，这与其他文献报道基本相似[14-15]。造成如此耐药现状可能与临床过度使用碳青霉烯类、头孢菌素类和青霉素类抗生素有关。

对碳青霉烯酶的表型检测以往都是运用改良Hodge试验，其检测KPC型A类碳青霉烯酶和OXA型D类碳青霉烯酶有良好的效果，但是对金属酶IMP、VIM和NDM-1检测效率不高[16]，为了提高B类金属β内酰胺酶的检出率往往联合针对B类碳青霉烯酶的EDTA双纸片协同试验，这加大了试验成本和操作难度。本研究运用新型的mCIM，能够检测所有主要的碳青霉烯酶[17]，本次8株携带blaNDM-1基因的阴沟肠杆菌mCIM试验全部阳性，结合blaNDM-1基因分析，提示该8株阴沟肠杆菌全部产B类碳青霉烯酶，且为NDM-1型金属酶。

ERIC-PCR是一种简单、快速、便捷的基因分型技术，适合同源性初步筛查，本次ERIC-PCR结果将8株blaNDM-1基因初步分为4个不同类别的基因指纹图谱型，其中部分菌株的同源性非常高，说明我院产NDM-1酶的阴沟肠杆菌存在部分的克隆传播现象。

在全球范围内blaNDM-1基因常由肠杆菌科细菌携带，数目最多的是肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌[18-20]。本次研究在对碳青霉烯类抗生素不敏感的阴沟肠杆菌中发现了8株携带blaNDM-1基因菌株，且多为以碳青霉烯类抗生素耐药为主的多重耐药株。而以往少见的耐药肠杆菌科细菌成为现今临床常见的造成严重感染的耐药菌种之一。为避免耐药细菌的不断增多及耐药谱的扩大，医院临床科室及有关防控部门应当引起重视，建立有效的监测体系和防控措施，遏制细菌耐药不断增长的趋势，避免造成不良后果。