基于酒曲中产凝乳酶微生物菌株的分离筛选及鉴定分析

2018-09-21唐贤华

现代食品 2018年15期

◎ 唐贤华

（四川工商职业技术学院，四川都江堰 611830）

酒曲本身含有微生物，此类微生物源自代谢与发酵的产物。通过筛选能够获得优良的霉菌原料，从而提炼出优质的凝乳酶。在细菌的辅助下，对微生物菌株有必要妥善予以筛选，同时还要妥善分离并且施行综合性的菌株鉴定处理。因此，在目前实践中，关于上述的酒曲分离与筛选技术应当侧重保障最根本的菌株安全，在此前提下完成精确的菌株鉴定操作。

1 微生物菌株的筛选与分离

1.1 菌株筛选

在初次筛选菌株时，针对发酵酒曲可以借助纯化与分离的方式来获得纯净度较高的菌落形态。在此前提下，确保将酪蛋白平板连接于各个菌株的相应位置上，然后将其置于恒温培养箱并且完成2 d左右的菌株培养。通过全方位的菌株测定与菌株观察，可以测出其中的水解圈与凝乳圈直径大小[1]。

具体在筛选不同菌株时，如果测定的水解圈直径为零，则意味着此类菌株并不会生成相应的凝乳酶成分。反之，如果菌株本身表现为较大的白色凝乳圈，则意味着此类菌株具备较高的凝乳活力。从干酪风味的角度讲，经过水解处理以后的菌株活力很可能影响特殊的干酪风味。可见，在筛选多种菌株时，最好选择较低水解活力并且富含较多蛋白成分的微生物菌株。

1.2 菌株分离

对于不同特性的微生物菌株有必要妥善予以分离，然后分别测定相应的凝乳酶比例。在初次筛选的基础上，运用酪蛋白法可以选出其中具备独特优势的微生物菌株，并且将上述菌株放置于酪蛋白的平板范围内进行分离。经过菌株的全面分离操作以后，还需经过一天的菌株培养，而后才能生成活化种子液。在不同的培养基内，至少需要完成1 d的菌株培养操作，确保其符合120 r/min的摇床振荡频率以及30 ℃的菌株培养温度[2]。

通过观察各类菌株，可知在4 h以内的时间段内，微生物菌株的生长速度相对缓慢，而与之相应的生物量也会基本维持恒定。到了12 h的时候，多数微生物菌株都能达到最快的菌株生长速度，其中某些菌株呈现几何级的菌类细胞增长趋向。在此之后，凝乳酶将会缓慢降低凝乳酶活性，直至与蛋白水解的活性大体相同。

2 具体的菌株鉴定技术

对于分离以后的微生物菌株来讲，应当将其置于固体平板的相应位置上。经过两天的菌株划线培养以后，观察可见菌落整体上呈现淡黄色或者乳白色，其中粗糙表层上带有不透明的黏液，并且呈现不整齐的菌落边缘状态。通过运用穿刺试验的方式，可以测出其中含有芽孢菌类与革兰氏菌类。具体而言，LB类型的菌株呈现短杆的形态，经过检测可得阳性的革兰氏反应结果。与此同时，此类菌株还呈现显著的运动性，菌株中间生长芽孢。

在测定蛋白具备的水解活性时，应当将酪蛋白溶液（1.5%，2 mL）置于35 ℃条件下5 min，然后在现有的溶液内部增添酶溶液（0.5 mL）。经过1 h的恒温水浴处理以后，确保将上述溶液予以均匀混合。对于上述的测试过程，如果要终止整个测试反应，则需加入三氯乙酸（8%浓度，2 mL）。在确保溶液已经完全沉淀以后，就可以制作成待测的空白样本。对产凝乳酶的菌类进行测定时，最好选择LB平板。经过恒温培养以后，观察可知革兰氏菌或者芽孢染色体的菌类形态，从而整体掌握菌类的基本形状，以便于妥善分离选择。

此外，关于鉴定菌株，还可选择PCR扩增的新型鉴定技术。具体在实践中，通过运用琼脂凝胶电泳以及产物扩增的方式，观察可看到有特异性的条带产生。在此基础上，运用纯化回收酒曲产物的方式再次测定其中的菌株序列长度，可得大约1 400 bp左右的序列长度[3]。对于GSBa的凝乳酶种类而言，观察可知此类菌株呈现棉絮的蓬松状，并且外表呈现浅灰色。相较于其他种类的凝乳酶，此类凝乳酶菌株呈现相对较长的凝乳反应时间。序列扩增获得的菌株鉴定结果，如图1所示。