不同培养时期酒曲变化规律研究

吴再节，方 焰，孙 伟，崔 磊，蒋 超，董思文，李剑峰，常 强

(安徽文王酿酒股份有限公司，安徽临泉236400)

文王贡酒经过几百年的历史文化积淀，形成了独特个性风格特点。“曲是酒之骨”道出了酒曲之于酒的重要性,主要利用相关物料进行微生物生长繁殖、代谢而产生，酒曲质量越优，白酒的质量越好。在酒曲中有丰富的物系、菌系与酶系等，酒曲培养过程是酒曲微生物菌群演变和物质间生化反应的生态变化过程。酒曲作为酿酒过程中的糖化、发酵、生酸、生香剂，从而直接或间接影响文王贡酒的产量、质量及特色。本研究从文王贡酒的酒曲培养入手，采集不同培养时期酒曲，进行相关跟踪调查、检测分析等，考察不同培养时期酒曲有关规律，旨在为文王贡酒更加高效合理地推动酒曲培养达到优化可控等。

1 材料与方法

1.1 材料

选用不同培养时期（料醅、揭房、中火、顶火、后火、退火和出房）酒曲开展分析。分析的酒曲均由文王酒业制曲车间提供，工艺操作按文王酒业制曲标准工艺执行。

1.2 方法

从培养时间0 d开始，每间隔5 d左右从不同培养时期酒曲的曲房中随机选取酒曲7个样品，样品名分别为Wjq05-0、Wjq05-1、Wjq05-2、Wjq05-3、Wjq05-4、Wjq05-5、Wjq05-6。放于事先准备好已经做好标识的密封袋中，置于冰箱低温保存待用。分别进行理化分析与生物分析等。相关理化、生物指标分别按1.3及1.4中的方法测定。

1.3 酒曲理化分析方法

1.3.1 水分测定

采用烘干恒重法测量酒曲水分含量。

1.3.2 酸度测定

根据酸碱中和反应，用中和法测定酸度，其反应式为：RCOOH+NaOH→RCOONa+H2O，以100 g酒曲消耗NaOH的毫摩尔数表示。即每100 g酒曲消耗1 mmol NaOH为1度酸度。

1.3.3 淀粉测定

准确称取曲粉1.00 g，置于250 mL锥形瓶中，加1∶4 HCl液100 mL，安装好冷凝器，沸水浴中转化30 min，用NaOH溶液中和、过滤，加水定容至250 mL，采用斐林试剂法进行测定。

1.3.4 糖化力测定

采用斐林溶液滴定快速法测定。按照QB/T 4257—2011标准中糖化力的测定方法进行。

1.3.5 发酵力测定

酒曲是糖化发酵剂,其中的酵母能使酒醅中还原糖发酵，生成CH3CH2OH和CO2。测定发酵过程中生成的CO2量，以衡量酒曲的发酵力。当灭菌冷却后的糖化液在无菌条件下，加入酒曲样品1.00 g，发酵栓中加入2.5 mol/L的H2SO4。然后放入25℃保温箱中发酵72 h，取出发酵瓶，轻轻摇动，使CO2全部逸出，称量CO2生成量。

1.4 酒曲生物分析方法

高通量测序实验流程：微生物组总DNA提取→目标片段PCR扩增→扩增产物回收纯化→扩增产物荧光定量→测序文库制备→上机进行高通量测序。

2 结果与分析

2.1 酒曲理化指标分析

选取不同培养时期的酒曲，通过理化指标分析，结果见表1。

表1 各时期酒曲理化指标

从表1可知，不同培养时期酒曲的水分含量在12.1%～34.6%之间、酸度介于0.4～1.4 mL/g之间、淀粉则在52.09%～67.10%之间、糖化力则分布在972～1074 mg/g·h之间、发酵力则分布在29～241 g[CO2]/100 g·72 h之间。可以看出，不同培养时期酒曲的水分含量与淀粉含量有逐渐降低趋势，同邢钢等[1]的研究中水分和淀粉含量一直在下降较为一致，酒曲酸度为逐渐增加趋势，说明了培养微生物需要消耗淀粉等，酒曲糖化力与发酵力高低起伏，说明稳定性不佳等,酒曲刚入房时，糖化力就很高,因小麦等原料本身带有糖化酶等，结果与杨代永等人的研究相一致[2]。

2.2 酒曲高通量测序生物分析

选取不同培养时期酒曲，通过高通量测序分析，结果如下。

2.2.1 细菌菌群结构分析

对253043条片段的分析结果见图1，图1表明，绝大部分的样品长度在385～398之间，77.5%的片段长度为393或394。

7个样品中，用于测序结果分析的片段数量分别为：Wjq05-0样品（35734），Wjq05-1样品（33456），Wjq05-2样品（31051），Wjq05-3样品（30955），Wjq05-4样品（45291），Wjq05-5样品（32645），Wjq05-6样品（43911）。其中Wjq05-6与Wjq05-4样用来测序的片段数量相对较多，但总的说来片段数量大致相同，分析均一性较好。

图1 细菌菌群结构分析图

表2及图2为各个样品中所检测到的微生物种类的数量。由表2和图2可知，在酒曲的制作过程中，细菌结构经历了从相对简单的菌群变为复杂菌群，最后回到相对简单菌群的过程（制作酒曲的原料中细菌种类很丰富，但很多微生物由于相对数量较小，在菌群中的比例较低而无法被检测到）。

表2 各分类水平的细菌类群数统计表

图2 各个样品中所检测到的细菌种类的数量

在不同的分类等级下，酒曲中细菌菌群的结构及主要微生物分别如图3所示，图3中最底部的黑色部分为目前无法被鉴定的微生物。在门水平上未鉴定的微生物较少，而从目等级开始未鉴定的微生物比较明显，说明部分微生物可以确定属于哪个门，但无法确定属于哪个目。

图3 酒曲中细菌菌群的结构及主要微生物门类

2.2.2 真菌菌群结构分析

对344253条片段的分析结果见图4，图4表明绝大部分的样品长度在370～405之间，71.5%的片段长度为398。

7个样品中，用于测序结果分析的片段数量分别为：Wjq05-0样品（39435），Wjq05-1样品（39431），Wjq05-2样品（39442），Wjq05-3样品（39431），Wjq05-4样品（39426），Wjq05-5样品（39421），Wjq05-6样品（39438）。片段数量基本相同，分析均一性很好。

表3和图5为各个样品中所检测到的真菌微生物种类的数量。由表3和图5可知，在酒曲的制作过程中，真菌结构同样经历了从相对简单菌群变为复杂菌群，最后回到相对简单菌群的过程（制作酒曲的原料中真菌种类很丰富，但很多微生物由于相对数量较小，在菌群中的比例较低而无法被检测到）。

图4 真菌菌群结构分析图

表3 各分类水平的真菌类群数统计表

图5 各个样品中所检测到的真菌种类的数量

在不同的分类等级下，酒曲中真菌菌群的结构及主要微生物见图6。

图6 酒曲中真菌菌群的结构及主要微生物

3 结论

(1)通过不同培养时期酒曲样品分析对比发现，随培养时间的延长，酒曲培养过程中水分含量变化为递减趋势，前期减少速度较快，后期减少速度放缓，且微生物前期生长旺盛，后期生长减缓。说明微生物的生长需要适宜水分，水分是培养酒曲的重要影响因素之一。

(2)酒曲培养过程中酒曲酸度变化为递增趋势，可能是因为培养前期因微生物代谢旺盛，产酸速度较快。通过分析对比，培养后期由于酒曲温度的升高,水分的减少，细菌数量减少，酸度升幅也随之降低。酸度的大小和细菌数量变化密切相关。

(3)酒曲培养过程中酒曲淀粉变化有降低趋势，淀粉含量由最高67.10%到最低52.09%，相差约15%，这些淀粉应该被微生物所分解利用等。酒曲中淀粉含量与其液化酶和糖化酶活性关系密切，一般优级曲淀粉含量相对较低，液化酶和糖化酶活性相对要高些。

(4)通过不同培养时期酒曲样品分析对比，随培养时间的延长,酒曲糖化力不稳定偏向递减趋势，因小麦等原料本身带有糖化酶等，曲醅刚入房时糖化力就很高，随着微生物大量繁殖代谢，酒曲醅温度的升高，霉菌的代谢受到抑制，糖化力下降；进入后火排潮期后，随着酒曲温度逐渐降到室温，糖化酶发生变化，酒曲培养过程中糖化力变化与温度变化较大。糖化力是糖化型淀粉酶将淀粉糖化生成葡萄糖的能力。糖化力的变化趋势与酒曲霉菌变化的趋势不一致，且前期压料成型后,用QB/T 4257—2011标准中糖化力的测定方法检测的料醅曲样品糖化力很高,加酵母糖化发酵后也基本不产酒,此糖化力测定方法不能有效反映出霉菌等生长状况及其糖化酶糖化能力等,应改进检测方法为妥。

(5)发酵力是酒曲发酵糖生成酒精和产生二氧化碳的能力强弱的评价。酒曲发酵力变化趋势与酒曲中的酵母数量变化趋势较为一致，呈现出先增后减，再增加，然后维持在一个相对稳定的水平的趋势。由于原料中酵母很少，料醅发酵力测定结果最小，随着酒曲培养,曲温的升高，酵母数量迅速增多，发酵力随之迅速增大；之后随着品温的继续升高和酒曲水分的不断降低，环境条件不再有利于酵母在酒曲上生长繁殖，发酵力随之降低；经过高温后，随着品温的逐渐降低，酒曲发酵力又稍有回升等。通过分析对比，酒曲培养过程中发酵力变化与酵母量变化关系较为密切。

通过对不同培养时期酒曲理化指标与微生物菌群变化规律研究认为：水、酸度、淀粉、发酵力等理化指标变化规律与酒曲中的微生物菌群变化相关，可得到不同培养时期酒曲的群落变化规律，为制曲标准化与专业化提供了理论依据。

[1]邢钢,敖宗华,王松涛,等.不同温度大曲制曲过程理化指标变化分析研究[J].酿酒科技,2014(6)：20-23.

[2]杨代永,范光先,汪地强,等.高温大曲中的微生物研究[J].酿酒科技,2007(5)：37-41.