高效液相色谱-柱后衍生法检测大米中黄曲霉毒素B1方法分析

◎ 陈强胜

（怀宁县市场监督管理局稽查大队，安徽 怀宁 246100）

黄曲霉毒素B1是黄曲霉菌和寄生曲霉菌产生的二次代谢产物，毒性强，分布范围广，在很多食品中普遍存在，对人类健康的危害性极大。采用高效液相色谱-柱后衍生法对黄曲霉毒素B1有很好的检测效果。高效液相色谱法是近年来发展起来的一种检测方法，其原理是在高效液相色谱仪上添加柱后衍生系统分离，再用荧光检测器测定。与其配套的柱后衍生系统有碘衍生化法、溴衍生化法及较为先进的电化学衍生化法和光化学衍生化法。当前，该方法大多用免疫亲和柱来净化、分离，其净化效果优异。

本文主要采用高效液相色谱-柱后衍生法检测大米样品中的黄曲霉毒素B1，用乙腈-水溶液的混合溶液提取，提取液经免疫亲和柱净化和富集，净化液浓缩、定容和过滤后经液相色谱分离，柱后（碘试剂衍生），经荧光检测器检测，外标法定量。

1 试剂和材料

甲醇（CH3OH），色谱纯；乙腈（CH3CN），色谱纯；氯化钠（NaCI）；磷酸氢二钠（Na2HPO4）；磷酸二氢钾（KH2PO4）；氯化钾（KCI）；盐酸（HCI）；TritonX-100；碘衍生使用试剂，碘（I2）；AFT B1标准品（C17H12O6，CAS号：1162-65-8），纯度≥98%，经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。

2 仪器

高效液相色谱仪，日本岛津LC-20A，配有柱后衍生系统和荧光检测器。

3 测定条件

流动相：A相，水；B相，乙腈-甲醇（50+50）。低压梯度洗脱条件：A，55%；B，45%。色谱柱，C18柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）；流速，1.0 mL/min；柱温，40 ℃；进样量，40 μL；衍生溶液，0.05%碘溶液；衍生溶液流速，0.2 mL/min；衍生反应管温度，70 ℃；激发波长，360 nm；发射波长，440 nm[1]。

4 分析步骤

按照国标GB 5009.22-2016方法和黄曲霉毒素B1免疫亲和柱说明书处理大米样品。①样品提取，称取5 g（m）样品于50 mL离心管中，加入20.0 mL（V1）乙腈-水溶液，涡旋、混匀、离心后取上清液备用。②净化，移取40 mL（V2）上清液，按照净化操作步骤净化，收集全部净化液。要特别注意净化柱需要回至室温（25 ℃左右）样品经过亲和柱时要严格控制流速（1～2滴/s），以使其充分反应吸附。③洗脱，取2 mL（V3）甲醇洗脱净化柱，要严格控制洗脱速度（1～2 mL/min），再用真空泵抽干净化柱并收集全部洗脱液。④上样测定，经色谱柱分离进入碘衍生系统。由荧光检测器检测[2]。

5 测定谱图

用已知浓度的AFT B1标准品（C17H12O6，CAS号：1162-65-8）稀释得到5个不同浓度梯度的AFT B1标准液作为标准品，将步骤4处理得到的分离提取液作为未知样品。然后一并放入日本岛津LC-20A（配有柱后衍生系统和荧光检测器）的高效液相色谱仪中，并按照步骤3的测定条件进行测定。得到了很好的分离效果，谱图峰没有出现分叉、变形、拖尾现象，重现性好[3]。标准品谱图（由于篇幅有限只列出其中一个标准品的谱图）和样品谱图，分别如图1、2所示。

图1 标准品谱图

图2 样品谱图

6 结果计算

用5个不同浓度的标准品浓度和响应值绘制标准曲线，用此标准曲线加载样品谱图得到样品浓度ρ=2.012 μg/kg。结合步骤4中样品处理的质量和体积，代入公式（1）计算。

计算结果约为0.4 μg/kg

7 回收率试验

将已知不含黄曲霉毒素B1的4份大米样品中分别添加浓度为2.7、5.0、8.0、10.0 μg/kg 4个水平的黄曲霉毒素B1标准品，然后按照上述步骤和方法处理测定。得出平均回收率为88.95%

表1 添加回收率试验表

8 总结

柱后碘衍生法检出限为0.1 μg/kg。流动相在国标中给定的比例为A相68%、B相32%，但在实验中发现按照这种比例本实验室的液相色谱仪不能很好地分离标准物质，通过不断调整发现A相55%、B相45%能够取得很好的分离效果[4]。在该方法检测过程中免疫亲和柱的净化提取尤为重要，使用前亲和柱需要回至室温（25 ℃左右），样品经过亲和柱时候要严格控制流速以使其充分反应吸附，洗脱同样要控制流速以减少目标物流失，造成检验结果出现大的偏差[5]。