二甲双胍及有氧运动对肥胖大鼠骨骼肌脂联素和葡萄糖转运体4的影响

童俊露，王佑民，邓大同

(1.泰康仙林鼓楼医院，江苏 南京 210046；2.安徽医科大学内分泌与代谢病研究所，安徽 合肥 230022；3.安徽医科大学第一附属医院内分泌科，安徽 合肥 230022)

近年来，随着生活日益改善，肥胖、2型糖尿病、代谢综合征等内分泌代谢病的发病率明显增加，胰岛素抵抗是这些疾病共同的发病机制。脂联素(APN)作为脂肪因子可调节脂肪酸氧化和葡萄糖代谢，目前作为骨骼肌因子的研究正在探索中。葡萄糖转运体4(GLUT4)是骨骼肌以及脂肪细胞中最重要的葡萄糖转运体，亦可调节糖脂代谢。二甲双胍及运动是最常用的改善胰岛素抵抗的方法。本研究通过高脂饮食建立肥胖及胰岛素抵抗模型，了解二甲双胍及运动干预对骨骼肌中APN和GLUT4表达产生的影响，探讨APN及GLUT4在骨骼肌糖代谢中的作用。

1 材料与方法

1.1实验动物雄性4周龄清洁级SD大鼠50只，购自安徽医科大学动物实验室。本研究符合一般动物实验伦理的要求。本研究起止时间为2013年1月至2016年9月。

1.2饲料普通饲料(动物中心配制)，成分配比为：豆粕30%、高粱10%、玉米30%、标准粉10%、鱼粉10%、骨粉2.5%、酵母2.5%、黄豆5%；高脂饲料成分配比为：普通饲料55%、猪油12%、麻油3%、鸡蛋10%、花生5%、蔗糖5%、奶粉8%、食盐2%。

1.3试剂及仪器鼠胰岛素放免试剂盒(北京北方生物研究所)；BCA蛋白浓度试剂盒(碧云天生物研究所)；兔抗鼠APN(Acrp30)抗体、兔抗鼠GLUT4抗体(均为美国BIOWORLD公司)、β-actin一抗(美国 Santa Cruz公司)；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗及兔抗鼠二抗(均为北京中杉金桥生物有限公司)；盐酸二甲双胍肠溶片(施贵宝公司提供)；全自动生化分析仪(瑞士Roche Modular DPP公司)。

1.4大鼠饲养及干预分组50只SD雄性大鼠适应性喂养1周后，采用随机数字表法，分为普通对照组(NC组，11只)和高脂饲料组(HD组，39只)。NC组给予普通饲料继续喂养，HD组大鼠换为高脂饲料喂养，定期称重，12周后，筛选36只造模成功的肥胖大鼠(体质量高于NC组20%认为造模成功)采用随机数字表法分为游泳运动组(SE组，10只)、二甲双胍组(MT组，11只)、高脂肥胖组(HF组，11只)，另有7只大鼠在实验过程中因溺水、灌胃呛咳等原因死亡。SE组大鼠每天下午3点进行游泳运动，泳池为高1.5 m，直径2 m的圆柱形容器，运动时维持水温在(23±2)℃，每周6天，第1周每天20 min，之后每周每天增加15 min，直至每天1 h。MT组大鼠每只每天给予200 mg·kg-1的二甲双胍溶液灌胃，二甲双胍溶液为注射用水新鲜配制的混悬液，每只大鼠灌胃体积2 mL左右。所有大鼠均可自由进食，自由进水，生活环境温度为(25±1)℃，共干预6周。

1.5血清指标检测禁食8 h过夜，10%水合氯醛麻醉，称量体质量(BW)，下腔静脉采血，2 500 r·min-1离心10 min，分离血清，-80 ℃冰箱中保存以备测定各项代谢指标。分离腓肠肌组织，液氮中冻存。

使用全自动生化仪测各项指标：空腹血糖(FBG)、三酰甘油(TG)、胆固醇(TCH)。空腹胰岛素(FINS)水平使用鼠胰岛素放免试剂盒测定。

计算胰岛素抵抗指数：(HOMA-IR)=FBG(mmol·L-1)×FINS(mIU·L-1)/22.5。

1.6骨骼肌组织中APN、GLUT4的蛋白表达的程度取约100 mg的腓肠肌组织，冰上匀浆后加入细胞裂解液充分裂解，4 ℃ 12 000 r·min-1离心10 min，取上清液，使用BCA试剂盒测定蛋白含量，标记后置于-80 ℃保存。取等量蛋白沸水煮5～10 min变性后加样，SDS-PAGE电泳分离，转移至NC膜上，TBST封闭，分别加入APN(Acrp30)一抗(1∶300)、GLUT4一抗(1∶1 000)及β-actin 一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶2 000)孵育2 h，ECL曝光、显影、定影，蛋白质印迹法所得条带使用凝胶处理软件扫描成图片，分析目标条带灰度值。骨骼肌中的APN、GLUT4的灰度值与 β-actin的灰度值比值为蛋白的相对表达量，进行统计学分析。

表1 各组大鼠代谢相关指标的测定

注：整体分析为单因素方差分析；多重比较为HSD-t检验，角标a、b、c分别为与A、B、C组比较，P<0.05

2 结果

2.1血清学指标两两比较并结合主要数据分析：与正常对照(NC组)相比较，HF组大鼠的BW、FBG、TG、TCH、FINS、HOMA-IR指数均明显增高(P<0.05)。与HF组相比，SE、MT组BW、FBG、TCH、HOMA-IR指数下降(P<0.05)，SE组血TG下降(P<0.05)，MT组血中TG虽有所下降但差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.2各组大鼠骨骼肌组织中APN、GLUT4的蛋白表达两两比较并结合主要数据分析：与NC组相比，HF组骨骼肌中APN、GLUT4的蛋白表达量明显降低(P<0.05)；与HF组比较，SE组及MT组骨骼肌组织中GLUT4的表达均明显增加(P<0.05)；与HF组相比，SE、MT组骨骼肌组织中APN的表达明显增加(P<0.05)；SE组、MT组之间GLUT4的表达量差异无统计学意义(P>0.05)。见图1、表2。

表2 各组间大鼠骨骼肌组织APN、GLUT4蛋白表达比较

注：整体分析为单因素方差分析；多重比较为HSD-t检验，角标a、b、c分别为与A、B、C组比较，P<0.05

3 讨论

胰岛素抵抗是指机体对胰岛素的敏感性下降，是2型糖尿病、代谢综合征等内分泌相关疾病主要的发病机制，改善胰岛素抵抗，是多种疾病防治的核心。高脂饮食诱导大鼠肥胖及胰岛素抵抗的发生与人类肥胖及胰岛素抵抗的发病过程相类似，通常用于建立动物模型。本实验研究亦采用了这种方法造模，与普通对照大鼠相比，高脂饲料喂养的大鼠体质量增加大于20%，HOMA-IR指数明显增高，FBG、TG、TCH增高，FINS水平增加，提示肥胖及胰岛素抵抗大鼠造模成功。

APN最早在脂肪组织中发现，作为脂肪因子与脂联素受体结合可降低FBG、TG水平，调节糖脂代谢，具有改善胰岛素敏感性、抗动脉粥样硬化等保护作用[1]。近年来，在骨骼肌中也发现APN的表达，骨骼肌中APN的表达和调节是目前研究新方向。Esfahani等[2]多位学者在大鼠及人类的骨骼肌组织中均发现了APN的存在，有学者证实骨骼肌可以通过分泌APN，上调脂肪酸的氧化应激，减少三酰甘油含量，促进骨骼肌细胞中葡萄糖氧化，改善胰岛素敏感性。骨骼肌细胞膜GLUT4介导的葡萄糖转运是糖代谢中的限速步骤，在糖尿病SD大鼠模型中，GLUT4的高表达明显降低其空腹血糖[3]。体外实验显示，在高胰岛素的环境中骨骼肌细胞GLUT4的表达明显降低，且同时伴发转位障碍[4]。GLUT4在骨骼肌细胞膜中的转位途径有两种类型：(1)胰岛素依赖型途径：胰岛素及胰岛素类似物与胰岛素受体结合，激活GLUT4发生膜转位；(2)非胰岛素依赖性途径：由于运动、缺血、缺氧等因素，直接激活GLUT4膜转位过程[5-7]。高脂喂养的SD大鼠骨骼肌组织中，胰岛素信号转导途径中受体水平缺陷，使得GLUT4mRNA表达明显下降和GLUT4蛋白含量降低，从而导致葡萄糖转运、摄取、利用的减少及胰岛素抵抗的发生[8]。本研究结果得出类似结论，高脂饲料喂养的肥胖胰岛素抵抗大鼠的血糖、血脂较正常对照组明显增加，骨骼肌中APN及GLUT4明显降低，证实了APN和GLUT4的下调与胰岛素抵抗及糖脂代谢紊乱相关。

运动锻炼是临床中最常见改善胰岛素抵抗的生活调节方式。运动可以直接增加机体骨骼肌中GLUT4的表达和蛋白质的合成，促进GLUT4跨膜转运过程；增加骨骼肌细胞膜上胰岛素受体数量，使得胰岛素与受体结合增加，促进骨骼肌细胞GLUT4的膜转运，使GLUT4的含量提高；在运动锻炼肌肉收缩过程中，增加了细胞内钙离子含量，从而激活了钙调蛋白激酶活性来增加GLUT4的表达；同时运动过程中由于体内的ATP大量消耗，AMP的增加激活了AMPK介导的信号转导途径，GLUT4的膜转位增加，肌肉组织摄取和利用葡萄糖增加，从而改善胰岛素抵抗[9-11]。在本实验中，SE组较HF组FBG、TG、TCH下降，HOMA指数降低，骨骼肌中GLUT4的表达明显增高，进一步证实运动可以增加GLUT4的表达。目前针对运动对APN水平的影响尚有争议，有学者发现运动不能改变APN的水平，可能不是运动改善胰岛素敏感性的因子之一；国内另有研究发现，运动对血清及骨骼肌中APN均有上调作用[12]。在本研究中，SE组骨骼肌中APN表达较HF组明显增高，血脂、血糖降低，胰岛素抵抗改善，具体机制尚不明确，考虑可能与运动激活AMPK等信号通路有关，进一步促进GLUT4的转位。

二甲双胍是临床上最常用于改善胰岛素抵抗的药物，可以抑制糖异生，增加外周组织对葡萄糖的摄取和利用，提高胰岛素敏感性。二甲双胍可增加糖尿病模型中骨骼肌中GLUT4 mRNA和蛋白表达，促进胰岛素介导的骨骼肌GLUT4跨膜转运，增加外周组织对葡萄糖摄取促进。本研究在肥胖大鼠胰岛素抵抗模型中亦得到上述结论，二甲双胍干预的MT组大鼠骨骼肌组织中GLUT4的表达较HF组明显增加，作用机制可能为二甲双胍在改善胰岛素抵抗的同时可能直接促进GLUT4的表达。有关二甲双胍对组织APN表达的影响尚存不同的观点。Zulian 等[13]通过体内、体外实验证明二甲双胍可增加脂肪细胞和脂肪组织中APN的表达。有研究认为，二甲双胍对血清APN无明显改善作用[14]，但国内有学者研究发现，二甲双胍可升高2型糖尿病患者中血清APN的水平[15]。二甲双胍对骨骼肌细胞和组织中的APN的表达作用目前报道较少。

本实验中发现二甲双胍可增加骨骼肌GLUT4的表达，改善胰岛素抵抗和糖脂代谢，但并未显著增加骨骼肌APN的表达，具体机制目前尚不十分明确，但由于本实验干预时间短，样本量较小，二甲双胍及运动对骨骼肌APN的作用有待今后进一步探讨研究。

(本文图1见插图10-1)