小麦中呕吐毒素快速检测方法比较*

谢婷婷，林秀，陈凌峰

（福建省粮油质量监测所，福建 福州 350012）

目前，基于大型仪器的检测方法，由于仪器不具有便携性、样品前处理操作比较复杂、检测需要的时间较长、检测成本较高等原因无法满足短时间内得出实验结果和现场快速检测的需求。快速检测方法与大型仪器方法相比，是一种能够将样品前处理简化以及短时间内能对相关的质量安全指标得出检测结果的技术[1]。

近年来，粮食中真菌毒素的危害性受到广泛关注，其检测方法也越来越受到重视。呕吐毒素（vomitoxin），又名脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON），它是一种由镰刀菌属产生的毒性代谢产物，主要污染小麦、大麦、燕麦、玉米等谷类作物[2]。

粮食中呕吐毒素快速检测方法有酶联免疫吸附筛查法、胶体金快速定量法和时间分辨免疫层析法。酶联免疫吸附法(ELISA法)是把抗原和抗体的特异性免疫反应和酶的高效催化作用有机结合起来的检测技术[3]也是国标规定的筛查方法[4]。胶体金快速定量法是以胶体金层析免疫竞争为原理，以小分子化合物为检测对象，运用侧流技术发展起来的一种真菌毒素快速检测方法[5-7]，它具有检测速度更快、检测成本较低，操作更简单等优点。时间分辨免疫层析法(time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)是利用真菌毒素与荧光微球标记的特异性单克隆抗体反应，用时间分辨荧光免疫层析检测仪测定反应产物中的荧光强度，前期的研究结果已证实该检测方法可行[8]。

本文采用胶体金快速定量法、酶联免疫吸附法、时间分辨荧光免疫层析法及高效液相色谱法检测同一批小麦及其制品中呕吐毒素，比较几种快速检测方法的准确性、成本以及便携性等方面，以期为呕吐毒素的快速检测提供参考。

1 材料与仪器

1.1 试验材料

随机选取小麦若干份。

1.2 主要仪器

ROSA-M 真菌快速检测仪：Charm Sciences 公司；

ROSA-FAST5 呕吐毒素快速试纸条：Charm Sciences公司；

呕吐毒素免疫亲和柱：北京华安麦科科技有限公司；

高效液相色谱：岛津LC-20A；

真菌毒素时间分辨荧光免疫层析检测仪：江苏苏薇微生物研究有限公司；

电子天平：梅特勒-托利多AB204-L；

呕吐毒素标准品：美国Sigma公司；

甲醇：色谱纯；

1.3 试验方法

1.3.1 分样

按照GB 5491-1985《粮食、油料检验 扦样、分样法》的规定进行扦样、分样。

1.3.2 除杂

按照GB/T 5494-2008《粮油检验 粮食、油料的杂质、不完善粒检验》的规定去除样品中的杂质。

1.3.3 高效液相色谱法测定小麦中呕吐毒素

按照GB 5009.111-2016《食品安全国家标准 食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定》第2法 免疫亲和层析净化高效液相色谱法测定小麦中呕吐毒素。

色谱条件：C18柱（5μm，250mm×4.6mm）；

流动相：V(甲醇)∶V(水)＝20∶80；

流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：50 μL；检测波长：218 nm。

1.3.4 胶体金快速定量法测定小麦中呕吐毒素

准确称取10.00 g 试样于100 mL具塞锥形瓶中，加入50.0 mL 试样提取液，密闭，用涡旋振荡器振荡1～2 min，静置后用滤纸过滤，或取1.0～1.5 mL混合液于离心管中，4000 r/min 离心1 min。取滤液或离心后上清液100 μL于另一离心管中，加入1.0 mL稀释缓冲液，充分混匀待测。

将检测条平放在45-孵育器凹槽中，打开加样槽，准确移取300 μL待测溶液至检测条加样孔中，关闭孵育器盖。孵育5 min后，取出检测条观察质控线和检测线的显色情况，必须出现清晰齐整的质控线即C线。若出现下述4种情况，视为检测条无效：⑴ C线（质控线）不出现、弥散或严重不均匀；⑵T1或 T2线（检测线）严重不均匀；⑶ 待测溶液掩盖或模糊了T1、T2线或C线；⑷ 胶体金显色微粒没有通过T1、T2线或C线。

孵育完成后，选取读数仪呕吐毒素检测频道中“基质00”(MATRIX00)样品测定类型进行测定，读数仪显示样品中呕吐毒素的含量。

1.3.5 酶联免疫法测定小麦中呕吐毒素

准确称取5.0 g试样于具塞三角瓶中，准确加入25.0 mL 60%甲醇水溶液，振荡20 min，以定性滤纸快速过滤，收集滤液。取样品提取液1 mL加水4 mL混匀即得待测样液（稀释系数25）。

将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20～25℃）平衡1 h以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。控制温度在20～25 ℃。

将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置,加入标准品或样本50 μL到对应的微孔中，加酶标物50 μL/孔，再加入抗试剂50 μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25 ℃避光环境中反应30 min。小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤液250 μL/孔，充分洗涤4～5次，每次间隔10 s，在吸水纸上拍干。

加入底物液100 μL/孔，用盖板膜盖板后置25 ℃避光环境反应15 min。加入终止液50 μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450 nm处（建议用双波长450/630 nm检测），测定每孔OD值。

1.3.6 时间分辨荧光免疫层析法测定小麦中呕吐毒素

准确称取2.0 g样品至50 mL离心管中，准确加入20 mL水加盖，混匀。将离心管放置漩涡混匀器上涡旋提取2 min，于离心机4000 r/min离心5 min，得上清液。

将时间分辨荧光免疫层析定量检测卡从冷藏柜取出，平衡至室温后，将其平放，用移液器定量吸取50 μL上清液加入950 μL呕吐毒素稀释液中，充分混匀，吸取100 μL此混合液垂直滴加于加样孔中，于20～25 ℃室温条件下进行反应，开始计时。反应10 min后，将检测卡放入时间分辨荧光免疫层析检测仪中。读数完成后，自动计算待测样品中呕吐毒素含量。若待测样品中呕吐毒素含量超过检测线性范围，应使用提取液对其滤液进行稀释后，吸取100 μL加入稀释液中，重新进行读数。

1.3.7 数据分析

应用 Excel 软件进行数据处理进行统计分析。

2 结果与讨论

将高效液相色谱法的测定结果作为认定值，3种快速检测方法的测定结果与之比较，按以下公式进行计算。

正确度(%)=检测值/认定值×100%

2.1 胶体金快速定量法

胶体金快速定量法检测小麦中呕吐毒素，其结果与液相色谱法测定的结果相对比，正确度范围在102.9%～140.8%之间，平均为121.1%，结果见表1。胶体金快速定量读数仪中内含标准曲线，只需校准，大大避免了试剂对操作人员的危害。此方法要求条件低，操作简单，检测时间较短。与高效液相色谱法相比较，检测数据正确度也较高。

2.2 酶联免疫法

酶联免疫法检测小麦中呕吐毒素，其结果与液相色谱法测定的结果相对比，正确度范围在92.6%～134.6%之间，平均为105.8%（表2）。

从上表可以看出，酶联免疫分析法作为传统的小麦呕吐毒素筛选方法，其检测数据相对较准确，与高效液相色谱法相比，差值较小。同时其检测数据较为稳定，但是在操作过程，其要求的实验环境温度等因素也相对较高一些。

2.3 时间分辨免疫层析法

时间分辨免疫层析法检测小麦中呕吐毒素，其结果与液相色谱法测定的结果相对比，正确度范围在93.9%～135.7%之间，平均为108.0%（表3）。

从表3可以看出，与高效液相色谱法相比，时间分辨免疫层析法检测小麦中呕吐毒素的检测结果正确度较高。在其操作的过程中，检验步骤简单，仪器本身自带有标准曲线，减少了试剂毒性对人体的危害。

表1 胶体金快速定量法正确度分析

表2 酶联免疫法正确度分析

表3 时间分辨免疫层析法正确度分析

表4 几种小麦呕吐毒素检测方法的检测时间、成本、试剂毒性比较

2.4 检测时间、成本、毒性的比较

从表4可以看出，与传统的大型仪器方法（高效液相色谱法）相比较，快速检测方法有其明显的优势。对比检测时间、成本、毒性以及对操作人员的要求这几方面，快速检测方法具有短时间、低成本、健康环保以及便携性等优点。其中，胶体金快速定量法和时间分辨荧光免疫层析法是近年发展起来比较实用的快速检测方法，它们在检测小麦中呕吐毒素所需的检测时间是相对较短的，其试剂毒性对操作人员的影响也较小，操作简单，容易携带至现场进行检测。

3 结论

为了满足日益增长的粮食质量安全现场快速检测的需求，粮食快速检测方法也越来越被人们关注。胶体金快速定量法、酶联免疫法和时间分辨荧光免疫层析法这3种快速检测小麦呕吐毒素的方法，均具有良好的正确度，胶体金快速定量法和时间分辨荧光免疫层析法这2种方法的仪器适用于直接携带至现场进行快速筛查，成本较低，操作较为简单。酶联免疫法虽然操作简单，但是受到仪器以及环境温度的限制，更适用于进行初步筛查后的进一步确证。

在粮食收购期间，现场入库把关大量样品的快速初筛可根据实际需要选择合适的快速检测方法，更能有效地完成粮食收购工作。