水产品中孔雀石绿快速检测产品质量评估

苑婷婷，储成群，肖毅美，黄彬昌，李金燕

(深圳凯吉星农产品检测认证有限公司，广东 深圳 518000)

孔雀石绿( MG)为三苯甲烷类染料，曾被广泛用于预防和治疗各类水产动物的水霉病、鳃霉病和小瓜虫病等[1]，亦会为了延长磷受损鱼的生命用在运输过程或存放池内等流通环节。但因其均具有潜在的致癌、致畸、致突变等副作用，严重威胁着消费者的身体健康[2-3]。世界上许多国家已将孔雀石绿列为水产养殖禁用药物，中国于2002年5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》(农业部第193号公告)。由于孔雀石绿的药物治疗效果好且价格低廉，在水产养殖、流通中仍有部分养殖户违法使用，是目前造成孔雀石绿在水产中检出率居高不下的原因之一。

目前孔雀石绿主流检测方法是高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)，检出低限分别为0.5μg/kg和2.0μg/kg，日本和香港对孔雀石绿的不合格判定标准为2.0μg/kg。该技术除需配备昂贵的大型仪器和大量辅助实验设备外，前处理方法过于繁杂耗时，无法应对水产品质量监管发展需求。而发展较成熟免疫胶体金快速检测技术因具有简便快速等优点，被广泛用于对产地和流通市场的样品进行常规筛选检测[4]，却也常被质疑有如前处理复杂、假阳性率偏高、检测灵敏度低等技术短板。

为客观地分析和评价当前国内市场上此类(水产品孔雀石绿)免疫胶体金快速检测试剂盒产品的质量状况，课题组选取5款主流的国产市售的可用于现场检测水产品中孔雀石绿残留的免疫胶体金快速检测产品(简称孔雀石绿快检试剂盒)进行调研，通过实验验证其灵敏度、稳定性、实际样品检出符合率等技术指标，为从事水产品中药物残留监管的工作人员、水产品养殖和加工企业、农批市场等流通领域应用此类产品提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验材料

表1 5款孔雀石绿快速检测产品外观及标示情况比较

根据水产品孔雀石绿现场快速检测的适用性需求，课题组基于检测低限2.0μg/kg、无需大型的检测仪器、单个样品检测2 h内完成原则，筛选具有代表性的五家主流公司的产品进行比较研究，为避免影响公司的经营情况，本文将用A、B、C、D、E分别表示5款孔雀石绿快检试剂盒，其基本情况见表 1。

1.2 试剂与设备

孔雀石绿、隐色孔雀石绿及其同位素内标标准品(纯度≥95%，Dr.E)；乙腈、甲醇均为色谱纯(J.T.Baker)，二氯甲烷、无水乙酸铵、冰乙酸等试剂均为分析纯(上海国药集团)。液相色谱-串联质谱仪(美国 AB 5500)、电子分析天平(Sartorius BT25S-CW)。

1.3 试验方法

1.3.1 空白基质样品制备

选取不含孔雀石绿、隐性孔雀石绿残留的草鱼，去鳞、去皮，沿脊背取肌肉。样品均质混匀，18 ℃以下冷冻保存备用。

1.3.2 孔雀石绿快检试剂盒的评判

采用各产品说明书中提供的检测方法进行检测，试验中采用空白草鱼样品中对各产品进行灵敏度、重复性、准确性等加标试验，依据GB/T 19857-2005《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》方法对快检阳性样品进行符合性验证。

1.3.2.1 灵敏度试验

采用空白草鱼样品对标称检测限、2倍标称检测限、4倍检测限和10倍检测限进行加标试验，分别添加有孔雀石绿和隐性孔雀石绿标样，每个浓度做三次平行，并与空白样品进行对照。

1.3.2.2 重复性试验

各试剂盒提供的产品在灵敏度试验时不一致，故根据各试剂盒的实际灵敏度进行重复性试验。采用空白草鱼样品添加无色孔雀石绿标样，按照说明书的操作步骤，用同一产品在同一时间测定3个检测试剂卡，判定产品的重复性。

1.3.2.3 对比性试验

为了进一步验证试剂的准确性，联系厂家技术人员现场对比试验，分别同时做10个不同浓度盲样。

1.3.2.4 确性试验

为了验证试剂的准确性，选取15 批次孔雀石绿快检试剂盒判定为阳性样品进行上液质定量验证其准确性情况。

1.3.2.5 结果判读

检测结果为阴性、阳性和可疑结果(临界区间)3种,检测人员依照各孔雀石绿快检试剂盒说明书中描述的“结果判读原则”判定,并进行结果读取和记录。根据最终结果计算各孔雀石绿快检试剂盒的检出符合率。

2 结果与分析

2.1 灵敏度

按照各孔雀石绿快检试剂盒提供的说明书的操作步骤，以灵敏度试验方法进行试验，按各试剂盒给定的判定方法进行结果判定，在三个平行样品必须一致，试验结果如表2。

表2 孔雀石绿试剂盒灵敏度试验结果

注：“-”为阴性，未检出；“+”为阳性，能进行判定，有检出；“+/-”因颜色显现不明显，定义为临界区间可疑结果。

灵敏度方面，D、E试剂盒基本满足(隐性)孔雀石绿检测低限为2.0 μg/kg，但D试剂盒与标称检测低限1.0 μg/kg不符；而C试剂盒隐性孔雀石绿检测低限无法达到2.0 μg/kg，与标称不符；A、B试剂盒灵敏度验证存在较大偏差，检测低限在10.0μg/kg，与标称严重不符。

2.2 稳定性

由于各试剂盒检出限不同，将准确性试验中的检出限结果作为重复性试验的浓度，采用空白草鱼样品添加隐形孔雀石绿标样至相应的浓度，按照说明书的操作步骤用同一批次产品在同一时间测定3个样品，按照要求判定检测结果，具体如表3。

注： “-”为阴性，未检出； “+”为阳性，能进行判定，有检出， “+/-”因颜色显现不明显，定义为临界区间可疑结果。

稳定性方面，除A试剂盒稳定性较差外，其余4款试剂盒均表现良好。

2.3 对比性

为更客观真实体现试剂盒技术性能，故从取样到结果判定均由各试剂盒厂家技术人员独立开展。鉴于A、B两款试剂盒在加标浓度为5.0μg/kg情况下无法准确辨识，故不参与对比性试验。其余结果如表4。

表4 孔雀石绿试剂盒符合性试验结果

注： “-”为阴性，未检出； “+”为阳性，能进行判定，有检出； “+/-”因颜色显现不明显，定义为临界区间可疑结果。

由上述试验结果可知，3款试剂盒最多达到50%概率的符合性。而E试剂盒的假阳性率明显高于另外两家。

2.4 准确性

随机筛选15批次已知定量检测结果的样品，分别应用这5款试剂盒进行验证，进一步对其准确性及符合率进行评估，结果如表5所示。

表5 快检阳性样品定量检出符合率统计结果

注：“符合”代表快检结果与定量结果一致， “不符合”代表快检结果与定量结果不一致。

2.5 评价分析

通过从灵敏度、重复性、对比性、准确性四方面对这5款孔雀石绿快速检测试剂盒技术性能进行判定，汇总结果见表6。

表6 5款孔雀石绿试剂盒性能分析对比

注：“符合率”= 定量阳性数/快检阳性数*100%。

通过从最低检出限、检测时间、检出率和符合率系列数据进行测评，5款试剂盒均具有操作步骤相对简单，试剂种类精简，便于检测人员掌握等优势。但有3款灵敏度及定量结果符合性整体评价较差，D、E两款试剂盒技术性能勉强符合现场检测要求。在实验过程中发现存在一定比例的假阳性、假阴性结果，在目标物含量偏低时，其阳性结果显示存在一定的误差，不易辨别。推测其可能原因是试剂本身含有的抗原或抗体特异性较差，易受生物体其他成分干扰形成假阳性或假阴性结果。

3 讨论

作为水产品质量安全重点监控的孔雀石绿项目，其快速检测试剂盒已成为一种现场快速检测的监管手段。而其质量将直接影响监管的权威性和有效性[5]。刘欢等[6]曾对10种孔雀石绿快检产品进行比较研究，有7种产品的检测性能与其自身商标标识不符，产品不达标。钱蓓蕾等[7]曾对3种孔雀石绿快速检测试剂盒进行比较研究，结果显示有2种产品的检测限没有达到产品标识要求。伏慧明等[8]发现应用快速检测试剂盒类产品得出的检测结果往往与试剂盒所标示的各项技术指标相差甚远，出现假阳性的几率很大，严重影响检测方法的运用和结果的判定，如在实际监管中应用该产品进行检测，将可能检出大量的假阳性样品，增加监管部门使用仪器验证检测结果的负担,影响监管效率。依据文中试验情况分析，说明大部分基于免疫胶体金技术开发的孔雀石绿快检产品的灵敏度还不能达到准确定性、精确定量。孔雀石绿快速检测试剂盒市场确实存在相对混乱，产品质量良莠不齐的现象。建议在应用免疫胶体金类快速检测试剂盒进行水产品孔雀石绿残留检测前,有必要对试剂盒所标示的各项技术指标(如灵敏度、重复性、对比性、准确性等)进行逐一地验证，从而正确评估试剂盒技术性能及应用风险。