三七参芪胶囊安全性评价及缓解体力疲劳功能的研究

范治云，谭会萍，李志坤，陈峰，祝清芬

（1.山东省食品药品检验研究院，山东济南250101；2.济南市第三人民医院，山东济南250132）

三七（Panaxnotoginseng）为五加科人参属植物，已有600年以上的药用历史，其根、茎、叶、花均可入药。其含有皂苷、三七素、多糖、黄酮等多种成分，药理作用主要体现在对血液系统、心血管系统、脑血管系统、神经系统、代谢、免疫调节系统等的影响[1-2]；西洋参（Panax quinquefolium L.）亦为五加科人参属植物，其含有人参皂苷、多糖、氨基酸等多种有效成分，在抗肿瘤、心血管系统、调节免疫、代谢、抗氧化方面具多种药理活性[3]；黄芪（Astragalus membranaceus）是豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根，具有补气固表、利尿排毒、排脓、敛疮生肌之功效，其主要活性成分黄芪甲苷具有调节免疫、缺血保护、心脏保护、抗炎、抗病毒和抗肿瘤等作用[4-5]。三七参芪胶囊是以三七、西洋参、黄芪为主要原料，经粉碎、混合等工艺而制成的保健食品，根据卫生部《保健食品检验与评价技术规范》（2003年版）对三七参芪胶囊进行安全性评价及缓解体力疲劳的功能的初步研究[6]，为其在缓解体力疲劳功能方面保健产品开发提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 受试物

三七参芪胶囊（规格：0.45 g/粒；性状：透明硬胶囊；内容物为浅黄色粉末）：由某生物制药有限公司提供。保存条件：阴凉干燥处保存。保质期：24个月。

1.2 实验动物与菌株

ICR小鼠（SPF级，生产许可证号：SCXK（鲁）20140007）：济南朋悦实验动物繁育有限公司。饲养环境：屏障级动物实验室，使用许可证号：SYXK（鲁）20130012。温度：20℃～26℃，日温差≤3℃，湿度：40%～70%，换气次数：≥10次/h。照明时间：12 h明暗交替。

Ames试验标准菌株 TA97、TA978、TA100 和TA102：购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。

1.3 仪器与试剂

BP 211D电子天平：德国Sartorius公司；GHP-9270型恒温培养箱：上海一恒科技有限公司；XSC-小鼠恒温游泳池：安徽正华仪器有限公司；电子秒表：深圳市惠波工贸有限公司；7180型全自动生化分析仪：日本日立公司；TDZ5-WS型离心机：长沙湘仪仪器有限公司；UV-2550型紫外可见分光光度计：日本岛津公司；SBA-70A乳酸仪：山东省科学院生物仪器公司；代谢活化系统（S9，批号3516）：上海宝录生物科技有限公司；肝糖原试剂盒：南京建成生物工程研究所。

1.4 方法[6]

1.4.1 毒理学试验

1.4.1.1 小鼠急性经口毒性试验

选择体重18 g～22 g小鼠20只，雌雄各10只。按最大耐受剂量法（test of maximum tolerated dose，MTD）进行，经口灌胃给予最大浓度为0.34 g/mL的受试物混悬液20 mL/kg bw，1日3次，剂量合计20 g/kg bw，观察14 d，记录中毒体征及死亡情况。

1.4.1.2 Ames试验

TA97、TA98、TA100 和 TA102 4 种试验菌株经鉴定符合鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型的各项特性，采用平板掺入法，共设5个剂量组，剂量分别为0.008、0.04、0.2、1.0、5.0 mg/皿，另设阴性对照与阳性对照组。分别在加或不加S9混合液条件下以平板掺入法进行试验，每个菌株每个剂量均设3个平行皿，经37℃培养48 h后计数每皿回变菌落数，计算各组平均菌落数。

1.4.1.3 小鼠骨髓细胞微核试验

选择体重25 g～30 g的小鼠50只，按体重随机分为 5组，分别为 1.7、3.4、6.8 g/kg bw 3个剂量组，另设溶媒对照组及阳性对照组。阳性对照组经口灌胃给予环磷酰胺（40 mg/kg bw），溶媒对照组给予同等体积的0.5%的羧甲基纤维素钠溶液。采用30 h给药法，常规取胸骨制片、固定、染色，计算微核细胞率，及嗜多染红细胞与成熟红细胞比值（PCE/NCE）。

1.4.1.4 小鼠精子畸形试验

选择体重25 g～35 g雄性小鼠25只，按体重随机分为1.7、3.4、6.8 g/kg bw 3个剂量组，另设溶媒对照及阳性对照组，阳性对照组腹腔注射给予环磷酰胺（40 mg/kg bw），溶媒对照组给予同等体积的0.5%的羧甲基纤维素钠溶液。连续5 d，于首次给受试物后的第35天处死小鼠，取附睾制片，用高倍镜对每只动物检查1 000个精子。记录畸变的类型和数量，计算精子畸形发生率。

1.4.2 缓解体力疲劳功能试验

1.4.2.1 试验分组及受试物给予方式

小鼠按体重随机分为4个试验大组，每大组小鼠40只，分为溶媒对照组、受试物低、中、高剂量组4个小组，每小组10只。4个试验大组分别用于负重游泳实验、血清尿素测定、血乳酸测定、肝糖原测定试验。设三七参芪胶囊低、中、高剂量分别为0.45、0.9、2.7 g/kg bw，相当于人体推荐量的 5、10、30 倍剂量。临用前用0.5%的羧甲基纤维素钠溶液配制相应浓度的受试物溶液。各组小鼠灌胃体积为20 mL/kg，溶媒对照组给予同等体积的0.5%的羧甲基纤维素钠溶液，每天灌胃1次，连续30 d。

1.4.2.2 负重游泳实验

末次给予受试物30 min后，将尾根部负荷5%体重铅皮的小鼠置于游泳箱中游泳。水深30 cm，水温（25±1.0）℃，记录小鼠自游泳开始至死亡的时间，即小鼠负重游泳时间。

1.4.2.3 血清尿素测定

末次给受试物30 min后，在温度为30℃的水中不负重游泳90 min，休息60 min后，小鼠拔眼球采全血约0.5 mL（不加抗凝剂）。置4℃冰箱约3 h，血凝固后2 000 r/min离心15 min，取血清于生化分析仪上测定尿素含量。

1.4.2.4 肝糖原测定（蒽酮法）

末次给受试物后30 min颈椎脱臼处死动物，取肝脏经生理盐水漂洗后用滤纸吸干，准确称取肝脏100mg左右，按糖原测试盒说明书操作。

1.4.2.5 血乳酸测定

末次给受试物30 min后，不负重在温度为30℃的水中游泳10 min后停止，在游泳前眼内眦各采血20 μL：游泳后立即采血 20 μL；休息 20 min 后再各采血20 μL。用乳酸仪测定血乳酸，计算血乳酸曲线下面积。

血乳酸曲线下面积计算方法：

血乳酸曲线下面积=1/2×（游泳前血乳酸值+游泳后0 min的血乳酸值）×10+1/2×（游泳后0 min的血乳酸值+游泳后休息20 min的血乳酸值）×20

1.4.2.6 结果判定

负重游泳试验结果阳性，且血乳酸、血清尿素、肝糖元3项生化指标中任意两项指标阳性，即可判定该受试物具有缓解体力疲劳功能的作用。

1.5 统计学方法

2 结果与分析

2.1 毒理学试验

2.1.1 急性经口毒性试验

在14 d观察期内，实验动物未见中毒体征，生长良好，大体解剖未见异常。雌性、雄性小鼠经口MTD均大于20 g/kg bw，根据急性毒性分级标准，受试物属无毒级。

2.1.2 Ames试验

三七参芪胶囊Ames试验结果见表1。

表1 三七参芪胶囊Ames试验结果Table 1 The results of Ames test of SanQiShenQi capsule

由表 1 可知，采用 8、40、200、1 000、5 000 μg/皿 5个剂量，受试物各剂量组在加和不加S9条件下各菌株回变菌落数均未超过自发回变菌落数的2倍，各剂量组间亦无剂量反应关系，表明在加与不加S9条件下，受试物对鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100、TA102 4株菌株均未呈现遗传毒性。

2.1.3 骨髓细胞微核试验

三七参芪胶囊对小鼠骨髓细胞微核率的影响见表2。

由表2可知，各剂量组的微核率及PCE/NCE比值与阴性对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；阳性对照组微核率显著高于阴性对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。

表2 三七参芪胶囊对小鼠骨髓细胞微核率的影响Table 2 Effect of SanQiShenQi capsule on the micronucleus rate of mice bone marrow

2.1.4 小鼠精子畸形试验

三七参芪胶囊对小鼠精子畸形率的影响见表3。

表3 三七参芪胶囊对小鼠精子畸形率的影响Table 3 Effect of SanQiShenQi capsule on the malformation rate of mice sperm

由表3可知，各剂量组小鼠精子畸形率与阴性对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；阳性对照组的精子畸形率显著高于阴性对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.2 缓解体力疲劳功能试验

2.2.1 三七参芪胶囊对小鼠负重游泳时间的影响

三七参芪胶囊对小鼠负重游泳时间的影响见表4。

表4 三七参芪胶囊对小鼠负重游泳时间的影响Table 4 Effect of SanQiShenQi capsule on the weight loading swimming time of mice

由表4可知，低剂量组与溶媒对照组比较，负重游泳时间差异无显著性（P＞0.05），中、高剂量组与溶媒对照组比较，负重游泳时间显著延长（P＜0.05或P＜0.01）。提示三七参芪胶囊能明显延长小鼠的负重游泳时间。

2.2.2 三七参芪胶囊对小鼠血清尿素含量的影响

三七参芪胶囊对小鼠血清尿素含量的影响见表5。

表5 三七参芪胶囊对小鼠血清尿素含量的影响Table 5 Effect of SanQiShenQi capsule on the content of serum urea nitrogen in mice

由表5可知，低、中剂量组与溶媒对照组比较，血清尿素含量差异无显著性（P＞0.05），高剂量组与溶媒对照组比较，血清尿素含量显著降低（P＜0.01）。提示三七参芪胶囊能明显降低小鼠的血清尿素含量。

2.2.3 三七参芪胶囊对小鼠肝糖原含量的影响

三七参芪胶囊对小鼠肝糖原含量的影响见表6。

表6 三七参芪胶囊对小鼠肝糖原含量的影响Table 6 Effect of SanQiShenQi capsule on the content of liver glycogen in mice

由表6可知，低剂量组与溶媒对照组比较，肝糖原含量差异无显著性（P＞0.05），中、高剂量组与溶媒对照组比较，肝糖原含量显著增高（P＜0.01）。表明三七参芪胶囊能显著提高小鼠的肝糖原水平。

2.2.4 三七参芪胶囊对小鼠血乳酸含量的影响

三七参芪胶囊对小鼠血乳酸含量的影响见表7。

表7 三七参芪胶囊对小鼠血乳酸含量的影响Table 7 Effect of SanQiShenQi capsule on the content of blood lactic acid in mice

由表7可知，低、中、高3个剂量组与溶媒对照组比较，血乳酸曲线下面积差异均无显著性（P＞0.05）。提示三七参芪胶囊对小鼠血乳酸含量无显著影响。

3 讨论与结论

在急性经口毒性试验中，未见小鼠出现中毒体征，雌雄小鼠经口MTD均大于20 g/kg bw，根据急性毒性分级标准，表明受试物属无毒级；通过Ames试验、微核试验和精子畸形试验3项遗传毒性试验，结果均为阴性，提示受试物未显示有遗传毒性，表明三七参芪胶囊是安全的。

负重游泳试验是反应小鼠运动耐力的最直观的指标，游泳时间的长短可以揭示动物运动疲劳的程度。尿素氮是蛋白质代谢的最终产物。长时间运动后，血清尿素氮含量降低表明蛋白质参与供能的比例相对减少，糖原、脂肪在运动中供能得到相应加强。因此，血清尿素氮的含量的降低在一定程度上表征了机体抗疲劳的能力[7]。糖原是机体高强度运动的主要能量来源，肝糖原是能量储备的直接单位，运动导致大量糖原消耗，为维持血糖水平，肝糖原储备量大量消耗。受试物如能增加肝糖原储备量，则为机体提供更多的能量，达到抗疲劳的目的[7-8]。血乳酸是糖无氧酵解的最终产物，剧烈运动使体内乳酸堆积而引起运动性疲劳，因此，血乳酸水平可反应无氧代谢水平、疲劳的产生和消除速度[9-10]。

给予三七参芪胶囊30 d，中、高剂量组能明显延长小鼠的负重游泳时间，高剂量组能明显降低小鼠的血清尿素含量，中、高剂量组能显著提高小鼠的肝糖原水平。但3个剂量组对小鼠血乳酸含量无显著影响，对乳酸代谢方面的影响需要进一步研究。根据《保健食品检验与评价技术规范》2003年版判定标准，认为三七参芪胶囊具有缓解体力疲劳功能的作用，为其开发为缓解体力疲劳功能的保健产品提供了理论依据。