超早期针刺水沟穴对急性脑缺血大鼠纹状体氨基酸类神经递质的影响

于晓蕾,刘婧,毛群燕



超早期针刺水沟穴对急性脑缺血大鼠纹状体氨基酸类神经递质的影响

于晓蕾1,刘婧2,毛群燕3

(1.浙江省桐庐县中医院,杭州 311500;.2.浙江中医药大学附属第三医院,杭州 310005;3.浙江省龙游县人民医院,衢州 324400）

探讨超早期针刺水沟穴对急性脑缺血大鼠的纹状体细胞外液氨基酸类神经递质代谢紊乱的调节作用。实验大鼠均施行微透析套管埋置术,并以线栓法构建永久性大脑中动脉闭塞(permanent middle cerebral artery occlusion, PMCAO)大鼠模型;随机分为空白组、针刺组和模型组。针刺组予以针刺水沟穴,留针2 h;空白组和模型组不予任何干预,同时运用微透析技术对其纹状体细胞外液分4个时段进行微量透析取样,并应用高效液相色谱荧光法(high performance liquid chromatography with fraunhofer line discriminator, HPLC-FLD)监测微透析样品中谷氨酸(glutamic acid, Glu)、g-氨基丁酸(g-aminobutyric acid, GABA)含量的动态变化。模型组4个时段透析液中Glu含量有上升趋势(＜0.05);针刺组、空白组4个时段透析液中Glu含量相比较差异均无统计学意义(＞0.05)。模型组和针刺组4个时段透析液中Glu含量均较空白组增加(＜0.05);针刺组4个时段透析液中Glu含量均较模型组下降(＜0.05)。空白组、模型组和针刺组4个时段透析液中GABA含量比较差异均无统计学意义(＞0.05)。模型组和针刺组4个时段透析液中GABA含量均较空白组增加(＜0.05)。针刺组4个时段透析液中GABA含量与模型组比较差异无统计学意义(＞0.05)。超早期针刺水沟穴可有效调节急性脑缺血大鼠纹状体细胞外液氨基酸类神经递质代谢紊乱,减少缺血缺氧诱发的Glu过度释放,并维持GABA内源性抑制作用。

针刺;穴,水沟;脑缺血超早期;谷氨酸;g-氨基丁酸;大鼠

脑卒中是当今严重危害人类生命健康和影响生活质量的主要公共卫生问题[1-2]。我国的脑卒中疾病中,缺血性卒中占75%以上,特别是大脑中动脉闭塞占血管闭塞的43%[3]。脑缺血急性期的干预治疗对其预后具有决定性影响。目前,用于重新打开被阻塞血管的重组组织型纤溶酶原激活剂是治疗急性脑缺血最有效的药物,但由于其治疗时间窗的限制只适于很少数患者[4-7]。所以,探究对脑缺血急性超早期简、便、廉、效的治疗措施更值得关注。

局灶性脑缺血发生后,脑内氨基酸类神经递质发生变化。兴奋性氨基酸(excitatory amino acid, EAA)与抑制性氨基酸(inhibitory amino acid, IAA)相辅相成,协同运作于大脑中枢系统。以Glu为代表的EAA所引起的神经毒性作用既是脑组织损伤的启动者,又是执行者,进而导致神经细胞损伤的一系列病理反应;而以GABA为代表的IAA作为内源性脑保护剂,具有拮抗神经兴奋毒性的作用。

针刺疗法作为脑保护措施已被越来越普遍地应用于脑缺血急性期治疗,研究证实,针刺可有效地增强缺血损伤后神经元存活能力,减轻缺血损害程度,从而使预后得以改善[8-13]。基于急性脑缺血的治疗时间窗及针刺干预急性脑缺血相关研究日渐成为研究重点,人们越来越重视超早期针刺对急性脑缺血的介入效应。因此,本实验采用脑微透析联合高效液相色谱荧光技术测定脑缺血急性超早期大鼠的纹状体细胞外液氨基酸类神经递质含量以研究针刺对脑缺血急性超早期干预的介入效应,为针刺干预脑缺血急性超早期提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

清洁级健康雄性SD大鼠40只,体重250～270 g。实验动物购于中国科学院上海实验动物中心,由浙江中医药大学动物实验中心饲养。实验动物每笼5只分笼饲养,饲养温度维持在25℃左右,自由摄食和饮水。适应性饲养后,开始进行实验。

1.1.2 主要仪器及试剂

脑立体定位仪(型号68002),深圳市瑞沃德生命科技有限公司;激光多普勒血流仪(PeriFlux5000),瑞典PERIMED公司;微透析系列,日本Eicom公司;高效液相系列,美国安捷伦公司;谷氨酸标准品,美国安捷伦公司;g-氨基丁酸标准品,Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组

取250～270 g成年SD雄性大鼠40只,随机选取5只大鼠为空白组,其余为造模大鼠。全部动物均施行微透析套管埋置术,待修复3 d后,造模大鼠施线栓法闭塞右侧大脑中动脉构建PMCAO模型。PMCAO模型复制成功后随机分成模型组和针刺组。

1.2.2 微透析套管埋置术

将麻醉后大鼠固定于脑立体定位仪,充分暴露大鼠颅骨,将微透析套管埋置在纹状体(LB:9.0 mm、AP:﹢1.5 mm、ML:﹢2.8 mm、V:﹣4.0 mm),并将激光多普勒探头基座黏置在以AP:﹣3.0 mm、ML:﹢5.0 mm为中心[14]的颅骨表面,并埋置螺丝钉以加强固定。

1.2.3 PMCAO模型制备

PMCAO模型制备参照Longa线栓造模方法,并进行部分改良[15-19]。采用异氟烷吸入麻醉(动物吸入麻醉机,型号VMR,美国MATRX),应用激光多普勒血流仪(Laser Doppler Flowmetry, LDF)监测基础脑血流,将大鼠取仰卧位固定于手术架上,充分暴露右侧颈区,清晰分离右侧颈总动脉(common carotid artery, CCA),颈外动脉(extemal carotid artery, ECA),颈内动脉(internal carotid artery, ICA),枕动脉(occipital artery, OA)。将右侧CCA下端结扎;在右侧CCA上端(近ECA与ICA交界处)进行假性结扎,打一活结;在右侧ECA(OA)下端近“Y”形交叉处结扎;并用微动脉夹夹闭右侧ICA。在右侧CCA活结与死结之间(“Y”形交叉处下约3 mm处)作切口;将前端浸蜡的鱼线(直径0.26 mm)插入此切口,待线栓头插至ICA时,将CCA上端活结结扎,然后缓慢松开夹闭ICA的微动脉夹。继续进线16～18 mm至有轻微阻滞感[20-22],即线栓已插至大脑前动脉近段,此深度恰好堵塞大脑中动脉起始端口[23]。剪去多余鱼线,逐层缝合皮肤。应用LDF监测PMCAO造模后脑血流,由于大脑中动脉闭塞时局部微循环血流量可突然下降≥70%,待大鼠清醒后采用Bederson评分进行神经功能缺失评分(neurological deficit score, NDS)评定,0分为未见行为缺陷;1分为肢屈曲,即提尾悬空试验阳性;2分为侧推抵抗力下降,即侧向推力试验阳性,伴前肢屈曲,无转圈行为;3分同2级行为,伴自发性旋转。评分为2分及以上表明大脑中动脉阻塞成功,即清醒后出现左前肢屈曲,站立不稳,前进时向左侧倾斜。大鼠局部微循环血流量变化和NDS评定相互验证,作为PMCAO模型是否成功的标准[24]。

1.2.4 处理

针刺组大鼠予以针刺水沟穴,针刺2 h;模型组和空白组不予任何干预。

1.2.5 取样

对各组大鼠进行处理的同时,运用脑微透析技术对其纹状体细胞外液分4个时段进行微量透析取样, ①将微透析系统连接完整,将装有灌流液的微量注射器安置于灌流注射泵上,将注射器针头与转环相应入口、收集管针头与转环相应出口分别用连接管接连,收集管针针头插至收集装置相应孔道,收集装置内环境设置为4℃。灌流液成分为NaCl(147.0 mM)、KCl (4.0 mM)、CaCl2(2.3 mM)、MgCl2(1.0 mM)。②以2.0mL/min的速度进行灌流,查验微透析连接是否完整、通畅。③透析前体外探针检验,小心缓慢取出探针,将其浸润在装满超纯水的离心管内5 min,待其透析膜完全舒展,然后将浸润在超纯水中的探针入口端与微量注射器连接并以2.0mL/min的速度进行灌流,若探针出口端顺畅地有水珠流出,则示其透析膜良好完整,可备待用。④正式微透析取样,在异氟烷呼吸麻醉状态下将探针插入大鼠颅骨微透析套管内。将各组大鼠连接微透析系统,待1 h的探针平衡后正式透析取样。其中,针刺组在造模成功后予针刺水沟穴,针刺同时以2.0mL/min的速度进行为时2 h共4个阶段(0～0.5 h、0.5～1 h、1～1.5 h、1.5～2 h)的透析取样;空白组和模型组大鼠不予任何干预,同针刺组相同时间及条件下进行微量透析取样。

1.2.6 检测

应用高效液相色谱荧光法监测微透析样品中Glu、GABA含量的动态变化。

①试剂配备,流动相A:将14.32 g的Na2HP04溶于900 mL超纯水中,定容至1000 mL,再用H3P04调pH值至7.8;流动相B:将450 mL甲醇和450 mL乙腈共溶于100 mL超纯水中;将邻苯二甲醛(OPA)分装至离心管,50mL/管;备用。②色谱条件/氨基酸衍生,FLD波长(Ex/Em)为250/410;PMT为10;柱温为40℃;流动相A/B=100/0,梯度洗脱0～1.9 min;流动相A/B=61/39,梯度洗脱1.9～10 min。③进样程序:以最大速度(200mL/min)从硼酸盐缓冲液样品中吸取2.5mL,再从待测物样品瓶中吸取0.5mL样品,在空气中混合3mL,等待0.5 min,共2次,将针头置入超纯水的样品瓶中进行清洗,以最大速度(200mL/min)从放有OPA衍生剂的样品瓶中吸取0.5mL进行衍生,在空气中混合3mL,共6次,超纯水中清洗针头,在另一瓶超纯水中吸入32mL的超纯水后进样。各流动相流速为2 mL/min,单个样品10 min。④样品检测:取50mLOPA、100mL硼酸盐缓冲液(放入内插管)和2 mL超纯水(2瓶)放入相应样品瓶中,取微透析所得样品(即透析液)放入带有内插管的样品瓶中,按上述设定的程序进行检测。⑤绘制标准曲线:将Glu和GABA标准品分别稀释成0.02 nmol/mL、0.01 nmol/mL、0.005 nmol/mL、0.0025 nmol/mL、0.00175 nmol/mL,进样。根据高效液相峰面积绘制曲线。⑥样品出峰时间:在上述色谱条件下,样品中Glu出峰时间为1.03 min,GABA出峰时间为9.1 min。

1.3 统计学方法

所有数据采用SPSS17.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差表示,采用重复测量的方差分析对各组组内、组间以及组内和组间交互作用进行比较。各组组内因素的分析采用重复测量的方差分析,两两时间段比较采用检验进行分析,当校正系数Epsilon＜0.7时选择Bonferron Ⅰ法进行两两比较。各时间段上组间比较采用多因素方差分析,两两比较采用检验进行分析。以＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

PMCAO模型复制成功大鼠,即PMCAO术前与术后局部微循环血流量变化百分比≥70%且NDS≥2分的大鼠,共32只。PMCAO模型复制成功的32只大鼠中,经灌注取脑后证实探针埋置位置准确,且无脑出血现象的大鼠,模型组16只,针刺组12只。最终,对空白组(5只)、模型组(16只)、针刺组(12只)进行数据统计分析。

2.1 针刺水沟对PMCAO大鼠纹状体微透析液中Glu含量的影响(见表1)

结果显示,模型组组内因素存在效应(=6.044,＜0.05),模型组微透析液中Glu含量随时间变化呈上升趋势;而空白组和针刺组组内因素无明显差异(＞0.05),表明空白组和针刺组微透析液中Glu含量不随时间变化而改变。

结果显示,组间因素存在效应(=4.576,＜0.05),表明各组微透析液中Glu含量存在差异性。在相同时间段上各组间微透析液中Glu含量进行两两比较结果显示,模型组和针刺组在0～0.5 h、0.5～1 h、1～1.5 h、1.5～2 h4个时间段Glu含量均高于空白组(＜0.05),针刺组在0～0.5 h、0.5～1 h、1～1.5 h、1.5～2 h4个时间段Glu含量均低于模型组(＜0.05)。

表1 各组大鼠纹状体微透析液中Glu含量 (±s,×10﹣7mmol/L)

注:与同组前一时段比较1)＜0.05;与空白组比较2)＜0.05;与模型组的比较3)＜0.05

2.2 针刺水沟对PMCAO大鼠纹状体微透析液中GABA含量的影响(见表2)

结果显示,空白组、模型组、针刺组组内因素均无明显变化效应(＞0.05),表明各组微透析液中GABA含量不随时间变化而改变。

结果显示,组间因素存在效应(=4.778,＜0.05),表明各组微透析液中GABA含量存在差异性。在相同时间段上各组间微透析液中GABA含量进行两两比较结果显示,模型组和针刺组在0～0.5 h、0.5～1 h、1～1.5 h、1.5～2 h4个时间段GABA含量均高于空白组(＜0.05);针刺组与模型组在0～0.5 h、0.5～1 h、1～1.5 h、1.5～2 h4个时间段组间因素无明显差异(＞0.05)。

表2 各组大鼠纹状体微透析液中GABA含量 (±s,×10﹣7mmol/L)

注:与空白组比较1)＜0.05

3 讨论

本实验选取水沟作为干预穴位,观察其超早期针刺对急性脑缺血大鼠纹状体细胞外液的氨基酸类神经递质含量的影响。水沟穴是中风病急救穴,该穴归属督脉,而督脉为阳脉之海,所以水沟穴具有回阳救逆之功效;督脉“起于下极之俞,并于脊里,上至风府,入属于脑”,而脑为“真气之所聚”而藏元神,所以水沟穴可通过督脉连属于脑而疏通督脉之阳气以醒脑神、开清窍;又水沟穴位于面部口鼻之间,且为督脉、手足阳明经之会穴,所以该穴可醒神解闭、镇静安神、通调督脉、升阳通气。现代研究亦证实水沟穴对急性脑缺血具有良好的急救效应,可增加脑血流量,减轻脑缺血导致的神经损伤,有效地保护缺血神经元结构,促进机能恢复,缩短病程,降低致死致残率等[25-29]。

脑缺血急性超早期为发病的6 h内。脑动脉发生阻塞后,超早期的缺血缺氧导致的能量代谢障碍引起兴奋性氨基酸的释放将迅速不可逆地加剧脑损伤程度,与此同时,抑制性氨基酸作为一种内源性脑保护物质也将迅速反应性增加。本研究中模型组脑组织损伤局部细胞外液的Glu含量较空白组急剧堆积,且GABA含量也急剧增加。结果表明脑缺血急性超早期引起Glu兴奋性神经毒性作用导致神经细胞损伤,但与此同时脑内也反应性启动GABA的保护抑制。对于脑缺血急性超早期,最重要的是采取脑保护措施以降低神经细胞死亡。本研究采取针刺水沟穴对脑缺血急性超早期进行干预,结果显示针刺组脑组织损伤局部细胞外液中Glu含量较模型组急剧减少,而在急性脑缺血超早期针刺组脑组织损伤局部细胞外液中GABA含量较模型组无明显差异。所以本实验结果表明,超早期针刺水沟穴可显著改善急性脑缺血大鼠纹状体细胞外液氨基酸类神经递质失衡,在维持GABA的抑制性保护作用的同时可有效地减少Glu的释放。

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Effect of Ultra-early Acupuncture at Point Shuigou(GV26) on Amino Acid Neurotransmitters in the Striata of Rats with Acute Cerebral Ischemia

1,2,2,3.

1.311500,; 2.310005,; 3.324400,

To investigate the regulating effect of ultra-early acupuncture at point Shuigou (GV26) on metabolic disorders of amino acid neurotransmitters in striatal extracellular fluid in rats with acute cerebral ischemia.A microdialysis cannula was implanted in all the experimemtal rats. A rat model of permanent middle cerebral artery occlusion (PMCAO) was made by thread occlusion. The rats were randomized to blank, acupuncture and model groups. The acupuncture group received acupuncture at point Shuigou with the needle retained for 2 hrs. The blank and model groups were not treated. Striatal extracellular fluid was sampled by microdialysis in four periods of time. The glutamic acid (Glu) andg-aminobutyric acid (GABA) contents of microdialysis samples were measured using High Performance Liquid Chromatography with Fraunhofer Line Discriminator (HPLC-FLD) for dynamic observation.The Glu content of dialysate tended to increase in four periods of time in the model group (＜0.05). There was no statistically significant difference in the Glu content of dialysate between four periods of time in the acupuncture and blank groups (＞0.05). The Glu content of dialysate in four periods of time was higher in the model and acupuncture groups than in the blank group (＜0.05) and lower in the acupuncture group than in the model group (＜0.05). There was no statistically significant difference in the GABA content of dialysate between four periods of time in the blank, model acupuncture and groups (＞0.05). The GABA content of dialysate in four periods of time was higher in the model and acupuncture groups than in the blank group (＜0.05). There was no statistically significant difference in the GABA content of dialysate between the acupuncture and model groups in four periods of time (＞0.05).Ultra-early acupuncture at point Shuigou can effectively regulate metabolic disorders of amino acid neurotransmitters in striatal extracellular fluid in rats with acute cerebral ischemia, reduce ischemia and anoxia-induced excessive Glu release and maintain an endogenetic inhibiting effect on GABA.

Acupuncture; Point, Shuigou (GV26); Ultra-early cerebral ischemia; Glutamic acid;g-aminobutyric acid; Rats

1005-0957(2018)08-0951-06

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2018.08.0951

2018-02-20

国家自然科学基金青年基金项目(81303040)

于晓蕾(1989—),女,蒙古族,硕士,Email:yxl1108@126.com

刘婧(1982—),女,主治医师,博士,Email:liujing0113@126.com