载异烟肼纳米粒的制备及其体外抗结核活性研究

万月强，王新宏，郭 珍，王丽萍，贾 斐

(陕西省结核病防治院内二科，西安 710100)

结核病(tuberculosis，TB)是一种由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)引起的传染性疾病，主要传播途径为空气-呼吸道[1-2]。目前，我国结核病年发病人数约为130万，占全球发病人数的14%，位居全球第2位[3-4]。有效的抗结核化疗是结核病临床治疗的核心和关键，其中异烟肼(INH)是世界卫生组织(WHO)推荐的结核治疗方案中的一线主药之一[5-6]。但由于结核病的治疗联合药物多、疗程长、药物不良反应常见等，患者的药物依从率低，是结核病治疗失败或复发、结核杆菌耐药十分重要的原因。如何提高结核病治疗的药物依从率是各国研究者都要面对的问题。

药物的选择性分布改进了传统的给药方式，利用递药系统的靶向性使药物富集于靶器官，从而提高了药物的生物利用度及治疗效果，可降低毒性和不良反应[7-8]。近年来关于纳米递药系统的研究获得了重大进展。相对于传统剂型，载药靶向微粒的优势体现在：①靶部位可维持较高药物浓度，且持续时间长；②提高药物相对生物利用度；③降低药物毒性和不良反应，提高治疗指数；④降低给药次数，提高患者依从性[9-10]。如能通过改变现有的抗结核药物的剂型，从而使药物达到释控释和局部聚集的目的，对减轻药物毒性和不良反应以提高临床应用效果具有特别重要的意义。Ahmad Z等[11]利用复乳溶剂挥发法制备了益康唑及莫西沙星PLGA载药纳米粒，该纳米粒在小鼠靶器官内缓释可达6 d，而游离益康唑及莫西沙星在12～24 h后被靶器官清除。由于纳米递药系统的独特性，因此在抗结核药物的靶向给药、药物控释及缓释等研究领域具有广阔的应用前景。

葡聚糖是一种天然多糖，具有安全无毒、无免疫原性和生物可降解等优点，被广泛应用于生物医学领域[12-14]。此外，葡聚糖能够有效延长递药系统在体内的循环时间，增加药物在病变部位的蓄积[15]。基于文献研究基础，紧跟国内外在制剂学方面的进展，本研究拟以葡聚糖(DEX)为亲水性材料，以辛胺(OA)为疏水性材料，设计制备一种载INH的纳米粒载药系统。以透析法制备INH-DEX-OA，通过单因素实验对其制备工艺进行优化，并对纳米粒进行表征，进而考察纳米粒INH-DEX-OA的体外释药特性及体外抗结核活性，以期制备一个安全有效的载INH递药系统。

1 材料与方法

1.1仪器与试药 恒温磁力搅拌器(江苏金坛市科协仪器有限公司)；JN-900D 超声波细胞破碎仪(宁波江南仪器厂)；H-600-4 透射电子显微镜(日本 HITACHI公司)；Agiuent1200高效液相色谱系统(美国安捷伦科技有限公司)；Zeta电位及激光粒度分析仪(美国Beckman Coulter公司)；冻干机(美国GOLD-SIM公司)。葡聚糖(DEX-5000)、3,3-二硫二丙酸(DPC)和辛胺(OA)购自北京百灵威公司；利福平(INH)购自武汉富驰生物科技有限公司；其他试剂均购自西安科昊生物工程有限责任公司。

1.2方法

1.2.1二硫二丙酸-辛胺(DPC-OA)的合成 DPC-OA的合成路线见图1。在20 mL的1,4二氧六环中加入500 mg的DPC以及916.8 mg的EDCI，搅拌30 min，加入575.2 mg的NHS和150 μL的TEA，继续搅拌活化3 h，随后在反应液中加入217.6 mg的OA，反应12 h，TLC监测，反应结束后过柱分离获得产物。展开剂：二氯甲烷∶甲醇(10∶1)。

图1DPC-OA的合成路线

Fig.1 The synthetic route of DPC-OA

1.2.2葡聚糖-辛胺(DEX-OA)的合成 合成路线见图2。将一定量的DPC-OA、EDCI、NHS和TEA分别溶于DMSO中，充分溶解后加入DEX，反应12 h。结束反应后，过滤反应液，得淡黄色澄清液体，滤液用大量二氯甲烷沉淀，并反复用二氯甲烷清洗沉淀，甲醇润洗沉淀2次，随后将沉淀溶于蒸馏水中透析冻干，即得DEX-OA。通过1H-NMR和IR方法对合成的产物进行结构表征。

图2DEX(5K)-DPC-OA的合成路线

Fig.2 The synthetic route of DEX(5K)-DPC-OA

1.2.3载药纳米粒的制备工艺优化 (1)温度的影响:称取2 mg INH置于4 mL的DMSO中，分别在20，40，60 和80 ℃油浴中避光磁力搅拌1 h使其充分溶解；加入10 mg的DEX-OA，继续搅拌2 h后滴加32 mL蒸馏水，持续搅拌12 h。反应结束后，将反应液装入相对分子质量截留量为2 000的透析袋中，透析48 h。透析后冷冻干燥得载药纳米粒INH-DEX-OA。

(2)蒸馏水用量的影响:将2 mg INH溶于4 mL DMSO，60 ℃油浴中搅拌1 h使其充分溶解。随后加入10 mg的DEX-OA，继续搅拌2 h，最后分别缓慢滴加8，16，32和64 mL蒸馏水，搅拌12 h。反应结束后，将反应液装入相对分子质量截留量为2 000的透析袋中，透析48 h。透析后冷冻干燥得载药纳米粒INH-DEX-OA。

(3)投药量的影响:分别称取1，2，3 和4 mg的INH溶于4 mL DMSO中，在60 ℃油浴中避光磁力搅拌1 h使其充分溶解。随后加入10 mg的DEX-OA，持续搅拌2 h后缓慢滴加32 mL蒸馏水，持续搅拌12 h。反应结束后，将反应液装入相对分子质量截留量为2 000的透析袋中，透析48 h。透析后冷冻干燥得载药纳米粒INH-DEX-OA。

1.2.4载药纳米粒的表征 (1)纳米粒INH-DEX-OA载药量与包封率的测定：精密称取一定量的纳米粒，甲醇溶解后定容，采用HPLC法测定异烟肼的质量浓度。色谱条件：COSMOSIL 5C18-PAQ色谱柱(250 mm×4.6 mm)；流动相：乙腈∶水(30∶70)；检测波长为330 nm；柱温为35 ℃。根据测定结果计算异烟肼的载药量。

载药量=(纳米粒中药物量÷纳米粒的量)×100%

包封率=(纳米粒中包封的药物量÷制备纳米粒投入的药物总量)×100%

(2)纳米粒INH-DEX-OA粒径与Zeta电位的测定：称取一定量的载药纳米粒溶于蒸馏水中，制备质量浓度为1 mg·mL-1的纳米粒溶液，利用0.22 μm滤膜过滤，用纳米粒度分析仪测定纳米粒粒径和Zeta电位，测定3次取平均值。

(3)载药纳米粒形态观察：TEM观察纳米粒的外观形态：配制质量浓度为0.5 mg·mL-1的纳米粒溶液，利用0.22 μm滤膜过滤，滴于铜网膜上，处理后通过TEM观察。

1.2.5纳米粒INH-DEX-OA体外释药研究 称取2 mg载药纳米粒溶于10 mL的PBS(pH 7.4)缓冲液中，随后装入相对分子质量截留量为2 000的透析袋中，置于孵育液中，于37 ℃恒温摇床中振荡透析。间隔一定时间吸取透析袋外液，用HPLC法检测。以INH的累积释放量为纵坐标，时间为横坐标，绘制释药曲线。

1.2.6体外抗结核分枝杆菌活性 采用平皿二倍稀释法测定游离INH与纳米粒INH-DEX-OA的最低抑菌浓度(MIC)。在无菌平皿内加入1 mL 药液，再加MH培养基14 mL，混匀，使其药物终质量浓度分别为 128，64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25，0.12，0.06和0.03 mg·L-1；冷却后接种细菌，菌量为105cfu·mL-1。随后将无菌平皿置于37 ℃培养箱内孵育24 h，测定结果。

2 结果

2.1聚合物材料DEX-OA的结构表征 聚合物材料DEX-OA经冻干后得白色疏松状固体。采用1H-NMR对其进行测定。结果见图3A，OA的特征质子峰为2.32，1.51和0.98 ppm，DEX的特征质子峰为5.12，4.76，4.58以及3.0～3.8 ppm。结果表明，OA成功连接在DEX的长链上。IR对合成材料DEX-OA进行表征。结果见图3B，1 737 cm-1处是酯键C=O的伸缩振动特征峰，1 618 cm-1处是酰胺键C=O的伸缩振动特征峰，而1 655 cm-1处是DEX的氢键H-O-H所产生特征吸收峰。以上结果证实合成材料DEX-OA为目标材料。

2.2纳米粒制备工艺优化 温度变化对纳米粒的影响见表1。随着温度的升高，纳米粒INH-DEX-OA的粒径变小且分布更均一。在制备温度为60 ℃时，纳米粒的粒径约为90 nm，PDI为0.13；当温度增加至80 ℃时，纳米粒粒径大小与60 ℃时相近。因此最终选择温度为60 ℃。

图3DEX-OA的1H-NMR(A)和IR(B)图谱

Fig.31H-NMR (A) spectrum and IR spectrum (B) of DEX-OA

表1温度对纳米粒粒径的影响

Tab.1 The effect of temperature on nanoparticle size

温度/℃粒径/nm分散系数Zeta电位/mV20514±340.64±0.17-6.3±3.340304±190.35±0.16-7.8±4.66092±80.14±0.09-8.3±2.58089±60.13±0.03-6.4±3.4

蒸馏水用量对纳米粒特性的影响见表2。当蒸馏水用量为8 mL时，制备的纳米粒粒径大且分布不均一。随着制备纳米粒蒸馏水用量的增加，其粒径显著减小。其中蒸馏水用量为32和64 mL所制备的纳米粒无明显差别，最终选择蒸馏水用量为32 mL。

表2水相体积对纳米粒粒径的影响

Tab.2 The effect of volume of aqueous phase on nanoparticle size

蒸馏水/mL粒径/nm分散系数Zeta电位/mV8853±1320.53±0.15-4.2±4.116213±320.45±0.19-6.1±2.23287±180.21±0.06-7.8±3.26493±130.15±0.09-6.4±2.8

当INH投入量为1，2和3 mg时，粒径大小变化不大；但随INH的投入量增加到4 mg，其粒径明显增大，因此选择INH的投入量为2 mg。见表3。

2.3纳米粒的表征 (1)粒径及Zeta电位见图 4。纳米粒INH-DEX-OA的平均粒径为89±3 nm，PDI为 0.12±0.03，Zeta 电位为-6.8 mV。

(2)外观形态：由图4C可知，在TEM下观察，纳米粒INH-DEX-OA呈球形，表面完整光滑，无明显黏连现象，均匀度良好。

(3)载药量及包封率：用HPLC法测定的纳米粒INH-DEX-OA中INH载药量为9.6%±0.9%，包封率为86.4%±0.8%。

表3投药量对纳米粒粒径的影响

Tab.3 The effect of drug dosage on nanoparticle size

材料与DOX质量比/mg∶mg粒径/nm分散系数Zeta电位/mV10∶184±30.31±0.17-6.7±2.310∶279±60.21±0.12-6.3±1.610∶389±40.22±0.09-7.6±1.910∶4312±160.24±0.08-8.9±2.2

图4INH-DEX-OA的粒径分布(A)、Zeta电位分布(B)和透射电镜图(C)

Fig.4 The size distribution (A)，Zeta potential distribution (B) and TEM image(C) of INH-DEX-OA

2.4纳米粒体外释药 纳米粒INH-DEX-OA的体外释药过程整体较为平稳，无明显突释现象。其中在突释期纳米粒INH-DEX-OA中的INH释放度为17.2%，而最终平稳释药至50 h时，其累积释药度可达92.6%。见图5。

图5INH-DEX-OA在释放介质中的累积释药曲线

Fig.5Invitrocumulative drug release profile of INH from INH-DEX-OA

2.5体外抗结核分枝杆菌活性 采用平皿二倍稀释法测定目标化合物的体外抗结核分枝杆菌标准株(H37Rv)的活性，其游离INH和INH-DEX-OA的最小抑菌浓度(MIC)分别为0.252和<0.125 μg·mL-1。研究结果表明，纳米粒INH-DEX-OA的体外抗结核分枝杆菌活性(MIC<0.125 μg·mL-1)优于游离INH(MIC=0.252 μg·mL-1)。

3 讨论

药物治疗在临床中发挥了至关重要的作用，但是药物的毒性和不良反应影响治疗，尤其是对结核病这种需长期服药治疗的疾病。随着新型纳米技术的快速发展，药物制剂研究已进入递药系统时代，新材料、新技术的不断涌现将逐渐实现药物的靶向、定时、定位递送[16-17]。纳米递药系统因其具有良好的靶向性、优良的控释性以及更好的安全性而备受关注。

丁小力等[18]通过自乳化二元溶剂扩散法制备了载异烟肼和利福平纳米粒，该纳米粒表面完整光滑、粒径小、载药量高，体外释药结果显示，纳米粒的体外释药过程较平稳，提示该纳米递药系统具有一定的研究价值。通过自乳化二元溶剂扩散法制备纳米粒工艺繁琐且混有有机溶剂，这样不仅增加了纳米粒不均一的概率，同时对有机溶剂的有效去除也存在一定问题。此外该纳米粒药物包封率极低，是对原料药物的极大浪费。在本研究中，我们通过酰胺键连接合成制备了两亲性共聚物材料DEX-OA，并通过透析法将其制备为载药纳米粒。同时，实验研究了温度、透析水量及药物投量对纳米粒的影响。研究显示，制备温度升高可使纳米粒粒径变小且分布更均一。Rittschof D等[19]的研究结果同样显示，胶束粒径会随温度上升而变小。蒸馏水的用量影响纳米粒的形成，当溶液中材料浓度较高，不利于分子间深入水中，易产生聚集体沉淀。药物投量增加，纳米粒粒径增大，可能由于INH难溶于水，从而在纳米粒表面吸附[20]。经过优化处方后制备的纳米粒呈球形、粒径小、载药量及包封率高，且无有机溶剂残留。实验考察了纳米粒INH-DEX-OA的体外释药情况，显示纳米粒INH-DEX-OA释药平稳，无明显突释现象，结果提示，纳米粒INH-DEX-OA对INH的体外缓释作用显著。此外，体外抗结核活性实验结果表明，INH-DEX-OA具有更强的抗结核杆菌活性。

本研究通过合成两亲性共聚物，并通过处方优化制得了粒径小、载药量高、释药性能平稳和抗结核活性较强的纳米粒INH-DEX-OA，为其进一步体内抗结核活性研究奠定基础。