白花蛇舌草HPLC指纹图谱的研究

杨 健，郭书台,窦建卫

(1.西安市中医医院，西安 710003；2.西安绿叶药物研究有限公司，西安 710054；3.西安交通大学药学院，西安 710061)

白花蛇舌草为茜草科植物HedyotisdiffusaWilld.的干燥全草，收载于广西中药志[1]和江苏省中药材标准(1989年版)[2]，具有清热解毒、利湿消痈的作用，临床主要用于肠痈、疔疖肿毒、咽喉肿痛、毒蛇咬伤、湿热黄疸和小便不利等[1]；现代药理研究表明，本品有抗菌、增强免疫[3-4]、抗衰老和抗肿瘤[5-7]作用。白花蛇舌草主要产于福建、广东、香港、广西、海南、安徽和云南等地。白花蛇舌草中含三十一烷、豆甾醇、乌索酸、土当归酸[8-9]、β-谷甾醇、胡萝卜苷、熊果酸、2-羟基-3-甲基-1-甲氧基蒽醌、2-羟基-7-甲基-3-甲氧基蒽醌、E-6-O-对甲氧基肉桂酰基鸡屎藤苷甲酯、E-6-O-香豆酰基鸡屎藤苷甲酯[10]、香豆酸、对香豆酸甲酯、2-醛基-5-羟甲基呋喃、槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、胡萝卜苷[11]、车叶草苷、去乙酰车叶草苷、京尼平苷、10-去氢京尼平苷、交让木苷、diffusoside A、diffusoside B、松柏苷、鸡屎藤次苷甲酯、乙酰鸡屎藤次苷甲酯、去乙酰车叶草酸苷甲酯、羟异栀子苷、水晶兰苷甲酯、galioside 10-acetate、地芰普内酯[12]、鸡屎藤次苷甲酯、10-去氢京尼平苷和2-羟基-3-甲基蒽醌等成分[13]，此外还含有少量挥发性成分[14]。

中药指纹图谱是一种综合、可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性，整体性和模糊性为其显著特点[15-18]。由于白花蛇舌草成分较为复杂，很难将其中的单一成分或某一类成分作为测定指标来进行质量控制，因此考虑将指纹图谱纳入到药材的质量控制体系中，以便考察药材和制剂的相关性。本实验用福建产的白花蛇舌草药材作为原料基源，采用HPLC法对不同时间采收的药材进行了指纹图谱研究，建立了药材的指纹图谱控制方法。

1 仪器与试药

1.1仪器 高效液相色谱仪，DIONEX P680 HPLC Pump，UVD170U检测器，DIONEX Chromeleon 6.80色谱工作站(美国Dionex公司)；色谱柱(Phenomenex C18，150 mm×4.6 mm，5 μm)，广州菲罗门科学仪器有限公司；BS110S型分析天平，德国赛多利斯公司；AU250D型0.01 mg分析天平，日本岛津仪器有限公司；TDA-8002型恒温水浴锅，北京化玻联医疗器械有限公司。

1.2试药 槲皮素对照品(批号10081-200907)，熊果酸(批号110742-201202)，供含量测定用，由中国食品药品检定研究院提供；乙腈为色谱纯，Merck公司生产；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

福建省为白花蛇舌草的主产地之一，本实验所用药材均为福建福清地区不同采收期的药材样品，见表1。

表110批白花蛇舌草药材来源

Tab.1 The sources of 10 batches ofHedyotisdiffusaWilld.

样品编号产地批号采收时间1福建201407012014年7月2福建201408022014年8月3福建201409012014年9月4福建201507032015年7月5福建201508012015年8月6福建201509012015年9月7福建201509022015年9月8福建201607012016年7月9福建201608012016年8月10福建201608022016年8月

2 方法

2.1色谱条件 通过预实验研究，以C18柱作为分离色谱柱，流速为1.0 mL·min-1，分别在波长203，254，270和360 nm处检测，梯度洗脱程序见表2。

表2梯度洗脱程序

Tab.2 The gradient elution programs

时间/minA,乙腈/%B,2 mL·L-1磷酸水溶液/%05955892402278603565755545806040856040

结果表明，在梯度洗脱的情况下，以乙腈-2 mL·L-1磷酸水溶液为流动相对样品中各成分的分离效果较好，在203 nm波长处，检出的峰更多，且有多个峰的响应值较高，具有明显的特征性，故检测波长确定为203 nm。

2.2供试品溶液的制备 取药材，粉碎，过60目筛，取粉末2 g，置于具塞烧瓶中，加体积分数为70%的乙醇20 mL，超声提取30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇溶解，移至25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.3分析时间 在2.1项色谱条件下进样，考察2 h，结果表明，在85 min内，样品中所有峰均可完全被洗脱，故分析时间确定为85 min。

2.4参照峰的选择 根据文献报道，白花蛇舌草药材中含有槲皮素、熊果酸、豆甾醇和β-谷甾醇-D-葡萄糖苷等，还含有环烯醚萜苷类成分和车叶草苷等化学成分[8-14]。选用槲皮素作为对照品进行实验，结果槲皮素色谱峰很低，说明其在药材中的含量较少；又考察了熊果酸，结果在本色谱条件下均为较小的色谱峰，有些批次甚至没有检出，因此无法采用。经综合考察对比，供试品色谱图中峰面积最大的色谱峰与其他色谱峰能分离完全，没有干扰，经多次实验判断比较稳定，且在药材、中间体及成品中均能稳定存在，因此将其作为参照峰，计算各项指标。

2.5指纹图谱及其技术参数 取上述各批白花蛇舌草药材样品，按照2.2项下方法制备供试品溶液，在2.1项色谱条件下分别吸取10 μL进样测定，HPLC图见图1。对各批白花蛇舌草药材供试品指纹图谱进行分析，见图2，确定其共有峰作为药材的特征指纹色谱峰。

图1白花蛇舌草药材HPLC图

Fig.1 Typical HPLC chromatogram ofHedyotisdiffusaWilld.

结果显示，10批白花蛇舌草药材指纹图谱均分离出20多个色谱峰，将其结果导入计算机，比较并采用中药指纹图谱相似度软件计算，从中选定了16个共有峰作为药材指纹图谱稳定的特征峰，共有峰占总峰面积的90%以上，见图3和表3。

以7号共有峰作为参照峰，计算相对保留时间、峰面积比值、平均相对保留时间和平均峰面积比值，结果见表4。计算公式如下：

相对保留时间(tr)=色谱峰保留时间÷参照峰的保留时间

峰面积比值(Ax/As)=色谱峰峰面积(Ax)÷参照峰的峰面积(As)

图2白花蛇舌草不同批次药材HPLC图谱比较

Fig.2 HPLC chromatograms，comparison of theHedyotisdiffusaWilld. samples

图3白花蛇舌草药材指纹图谱

1～16.特征指纹峰。

Fig.3 Fingerprints ofHedyotisdiffusaWilld.

1-16.characteristic fingerprint peak.

白花蛇舌草药材指纹图谱共有特征峰其主要参数如下。

相对保留时间(共有峰号)：0.213±0.002⑴，0.390±0.002⑵，0.410±0.003⑶，0.640±0.002⑷，0.651±0.002⑸，0.720±0.002⑹，0.737±0.002⑺，0.877±0.005⑻，0.893±0.001⑼，0.928±0.005⑽，0.935±0.001⑾，1(S)⑿，1.035±0.008⒀，1.055±0.001⒁，1.089±0.001⒂，1.117±0.001⒃。

峰面积比值(共有峰号)：0.033±0.008 ⑴，0.101±0.025⑵，0.034±0.003⑶，0.027±0.004⑷，0.290±0.026⑸，0.105±0.009⑹，0.078±0.006⑺，0.196±0.044⑻，0.050±0.026⑼，0.115±0.014⑽，0.111±0.014⑾，1(S)⑿，0.240±0.050⒀，0.310±0.038⒁，0.072±0.111⒂，0.033±0.005⒃。

将10批白花蛇舌草药材指纹图谱实验数据导入中药指纹图谱相似度软件(中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版)，经中药指纹图谱相似度软件计算，得出白花蛇舌草药材指纹图谱的标准指纹图谱，各批样品均与标准指纹图谱比较，进行相似度计算，结果10批样品的相似度分别为0.995，0.998，0.996，0.998，0.996，0.989，0.998，0.989，0.996和0.997，相似度均大于0.95。

2.6方法学考察

2.6.1精密度实验 取同一份供试品溶液，连续进样5次，考察指纹图谱相似度变化情况，结果显示，相似度分别为0.996，0.990，0.994，0.992和0.991。结果表明，连续5次进样相似度无明显变化，RSD值为0.24%，表明仪器的精密度良好。

2.6.2稳定性实验 取同一供试品溶液，分别在0，2，4，8，12和24 h取样检测，考察指纹图谱相似度变化情况，测得相似度结果分别为0.995，0.990，0.992，0.989和0.994。结果表明，在24 h内，样品在各检测时间点的相似度无明显变化，RSD值为0.26%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.6.3重复性实验 取同一批号药材(20140802)共5份，按照2.2项下方法制备供试品溶液，在2.1项色谱条件下检测，考察重复性，结果5份样品的相似度分别为0.992，0.986，0.997，0.989和0.995。结果显示，同批药材的5份样品制备的供试品溶液进样后测定的相似度无明显差异，表明该方法重复性良好。

3 结论

HPLC法是目前药品质量控制过程中较常用的方法，该方法简便快捷、准确度高，在指纹图谱研究过程中常用[19-21]。

同一产地的白花蛇舌草不同采收期的药材有一定差异，经10个批次产品的测定结果比较后，从中选定了16个共有峰作为药材指纹图谱稳定的特征峰，共有峰占总峰面积的90%以上，不同采收期的药材与标准指纹图谱对照，相似度结果均在0.9以上。

所建立的该地区白花舌蛇草药材的指纹图谱具有较高的专属性，可作为药材的鉴别方法，以该地产的白花蛇舌草作为药材基源可确保不同批次的产品质量稳定。