海狗丸的体外活性研究

宁波御坊堂生物科技有限公司，浙江 宁波 315012

海狗丸是由海狗、枸杞子、益智、山药、蚕蛹和肉桂六味药物组成的复方制剂，具有抗疲劳的保健功效。海狗丸中的君药为海狗，本实验所用海狗丸选用加拿大纽芬兰养殖区海狗的海狗鞭入药。海狗鞭具补肾固元、补血益气、抗衰益寿等多种功效。

睾丸间质细胞主要功能是合成、分泌睾酮[1]，是睾丸中分泌睾酮的主要细胞，而睾酮在精子发生中起重要作用，其分泌活动主要由下丘脑、垂体及自身调节作用控制。睾丸间质细胞的研究无论在男性的生殖健康，还是机体的免疫调节，以及内分泌的调节方面都具有重要的地位[2-3]。研究结果表明：肾阳虚证患者通常存在肾上腺功能紊乱、甲状腺功能紊乱、性腺功能紊乱、垂体功能紊乱等内分泌失调现象[4-6]，故将肾阳虚证定位在下丘脑-垂体-靶腺轴(肾上腺、甲状腺、性腺)上。其中能够反映下丘脑-垂体-性腺轴的功能异常的主要指标包括血清睾丸酮(T)下降，双氢睾酮(DHT)降低，血清雌二醇(E2)升高[7]；同时当此性腺轴功能异常时，还会伴随着睾丸、前列腺、精囊腺等器官出现组织学改变。研究采用MTT比色法和生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)，考察海狗丸对大鼠的睾丸间质细胞增值及睾酮(T)分泌的影响，从细胞水平上探索海狗丸的壮阳生精活性，为海狗丸的药效研究提供参考和依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 HERAEUSHERAcell 150 CO2细胞培养箱(日本三洋公司)；SW-CJ-1CU双人单面超净工作台(苏州净化设备厂)；METTLER TOLEDO 电子天平(SARTORIUS AG)；细胞成像倒置显微镜(奥林巴斯公司)；Model 680型酶标仪(日本TAKARA公司)。

1.2 药物 海狗丸(批号：B17170001，宁波御坊堂生物科技有限公司)。

1.3 动物 Wistar大鼠，SPF级，雄性，11～12周龄，体重 260～280g，许可证号：SYXK(京)2017-0022。

1.4 试剂 胎牛血清、D-MEM / F12培养基、0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液均购于Gibco公司；Ⅰ型胶原酶和MTT均购于Sigma公司；人绒毛膜促性腺激素(HCG)购于宁波第二激素厂；大鼠睾酮(T)酶联免疫吸附测定检测试剂盒(ELISA)购于RAD公司。

2 方法

2.1 药物制备 将海狗丸样品用剪刀剪碎，电子天平精密称定0.001 g后置于1 mL容量瓶中，然后加入D-MEM /F12培养基溶解并定容，得到浓度为1 mg/mL的供试品溶液。再将上述供试品溶液用0.22 μm的滤膜过滤除菌，所得滤液待用且药物制备在细胞给药前配置。

2.2 睾丸间质细胞悬浮液的制备 依据参考文献[8-10]结合实验室条件进行实验方法学研究和设计，主要研究确定了细胞离体培养的时间、细胞换液的时间和次数、细胞铺板的密度、海狗丸的给药浓度、给药后细胞继续培养的时间等实验参数，对参考文献方法进行改进。将Wistar大鼠用10%水合氯醛麻醉，脱椎处死后用75%乙醇浸泡10 min，置于已灭菌处理的培养皿中，在无菌状态下用眼科剪和镊剪剖开下腹，除去睾丸外层的附睾组织，取出一侧完整的睾丸后，用预冷的PBS(0.01 mol/L，pH7.2)缓冲液进行冲洗后除去白膜，置0.05% I型胶原酶(约用10 mL)中轻轻吹打数次，使组织分散，37 ℃震荡水浴消化30 min。加入等体积含10%胎牛血清的D-MEM/F12培养液终止消化，然后用吸管吹打，使睾丸间质细胞充分散开。用4层纱布过滤，收集滤液，在1000 r/min条件下离心10 min，沉淀的细胞加入培养基吹打冲洗细胞中残留的消化液，低速(1000 r/min) 离心10 min，弃上清。用含10%胎牛血清的D-MEM/F12培养基10 mL吹打成均匀的悬浮细胞，接种于培养瓶中。在37 ℃、5%CO2培养箱条件下内培养36 h，待睾丸间质细胞贴壁，倾出培养液，用PBS缓冲液冲洗至瓶壁上没有漂浮细胞，再加入培养液培养2 d，此培养时间是由方法学考察后确定的。

定时观察细胞的生长状态，选取对数期细胞用于实验；当细胞生长到镜下观察覆盖80%～90%、细胞伸展成不规则形态时，用0.25%胰蛋白酶消化液进行消化，至细胞缩成小圆形并呈现部分轻轻浮动现象时，终止消化，弃去消化液。然后向其中加入5 mL培养基，用吸管吹下贴壁的Leydig细胞，进行细胞活度测定后，准备铺板。前期已对细胞铺板密度进行考察，将细胞铺板密度定为105个/mL。用含有10%胎牛血清的D-MEM/F12培养液调整细胞密度至105个/mL，取100 μL/孔的细胞悬浮液接种于96孔板(铺板)，放入37 ℃、5%CO2的培养箱内培养2 d，给药进行实验。

其中在细胞活力检测阶段：截取时间点分别为4 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h，分别给每孔加入20 μL MTT试液，继续于培养箱中培养4 h，将液体倒出，每孔加入100 μL DMSO，置于酶标仪震荡10 min，在490 nm波长下测定吸光度，以吸光度OD值为纵坐标、时间为横坐标，绘制睾丸间质细胞的生长曲线，如图1所示。

由生长曲线可知：细胞处于正常生长状态，在72 h左右，细胞处于稳定的状态，在24～72 h细胞基本处于对数生长期。

2.3 MTT法考察海狗丸对Leydig细胞的增殖作用

2.3.1 MTT的配制 称取MTT0.25 g，溶于50 mL的磷酸缓冲液(PBS)，用0.22 μm滤膜过滤除菌，取实验用量，放4 ℃避光保存备用。其余在无菌条件下，分装1.5 mL到2 mL EP管，置-20 ℃长期保存。

2.3.2 实验步骤 将铺板后的睾丸间质细胞培养2天后，弃去培养液，按实验分组对细胞进行给药处理。样品组每组分别加入海狗丸供试品溶液100 μL/孔(浓度分别为50 μg/mL、100 g/mL、200 μg/mL)，每个样品浓度设5个复孔。空白对照组加入D-MEM/F12培养液100 μL/孔，设5个复孔。阳性组加入含人绒毛膜促性腺激素(HCG)的D-MEM/F12培养液(含HCG终浓度为1 U/mL)100 μL/孔，设5个复孔。在37 ℃、含5%CO2条件下培养24 h后向每孔加入5 mg/mL的 MTT溶液20 μL，继续孵育4 h。取出培养板，将96孔培养板倾斜约30度角，小心吸去上清液后将每孔加入100 μL的DMSO，并立刻转移至酶标仪中在37 ℃振荡10 min后测定490 nm下的OD值[11]。

按公式计算睾丸间质细胞增值率：

细胞增殖率(%)=(实验孔OD值-空白孔OD值)/ 空白孔OD值× 100%

2.4 ELISA法测定Leydig细胞分泌的睾酮含量 参照文献方法[12-13]进行前期方法学研究，对参考文献方法进行改进和优化。其中主要确定了细胞的铺板密度，以及睾酮浓度与OD值呈线性的线性范围。将细胞密度为105个/mL的睾丸间质细胞悬液接种于96孔培养板中(100 μL/孔)，于培养箱中培养2 d后轻轻吸去培养液后给药。样品组每组分别加入海狗丸供试品溶液100 μL/孔(浓度分别为50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL)，设5个复孔。空白对照组加入D-MEM/F12培养液100 μL/孔，设5个复孔。阳性对照组加入含人绒毛膜促性腺激素(HCG)的D-MEM/F12培养液(含HCG终浓度为1 U/mL)100 μL/孔，设5个复孔。给药后置于37 ℃、5%CO2条件下培养，并检测给药24 h后大鼠Leydig细胞分泌的睾酮含量，按照大鼠睾酮(T)酶联免疫检测试剂盒说明书逐步进行实验，用酶标仪测定吸光值。

3 结果

3.1 睾丸间质细胞活性实验结果 本实验采用MTT法检测Leydig细胞增殖情况，得到海狗丸3个给药浓度对睾丸间质细胞增殖影响情况见表1。在给药24 h后，3个给药浓度的海狗丸样品均对大鼠睾丸间质细胞的增殖有促进作用，且促进作用随给药浓度升高而增强。其中低(50 μg/mL)、中(100 μg/mL)给药浓度的海狗丸样品的作用不明显，与空白对照组相比没有统计学差异(P>0.05)；而高浓度给药实验组(200 μg/mL)、阳性对照组分别与空白对照组相比较，存在极显著统计学差异(P<0.01)，说明对大鼠睾丸间质细胞增殖的促进作用强。

组别给药浓度OD值±标准差增值率/%海狗丸实验组200μg/mL0.75±0.02**44.2100μg/mL0.61±0.0917.350μg/mL0.56±0.117.7阳性(HCG)对照组1U/mL0.72±0.03**38.5空白对照组-0.52±0.01-

注：与空白组相比，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 ELISA法测定Leydig细胞分泌的睾酮含量实验结果

3.2.1 标准曲线的建立 利用试剂盒做睾酮标准曲线，得线性回归方程y=0.0343x+0.6566，R2=0.9995。检测睾酮浓度在1.0～32.0 nmol/L时与OD值呈线性关系，如图1所示。

3.2.2 睾丸间质细胞分泌睾酮的含量 将测得的OD值用标准曲线算出睾酮含量，并与空白对照组进行独立样本t检验。结果显示给药24 h后，阳性对照组(HCG)和海狗丸实验组(高、中、低3个浓度)与空白组相比，均不同程度的促进了睾丸间质细胞的睾酮分泌量，见表2。在给药24 h后，3个给药浓度的海狗丸样品，均具有促进睾丸间质细胞睾酮分泌的作用，且促进作用随给药浓度增高而增强。分别与空白对照组相比较：其中低给药浓度(50μg/mL)作用不明显，无统计学差异(P<0.05)；中给药浓度(100 μg/mL)就存在统计学差异(P<0.05)；而在200 μg/mL高给药浓度时，促进睾酮分泌的作用已优于1 U/mL阳性对照(HCG)，与空白组相比较有极显著统计学差异(P<0.01)。

组别给药浓度睾酮(T)OD值±标准差含量/nmol/L海狗丸实验组200μg/mL1.69±0.07**30.13100μg/mL1.25±0.09*17.3050μg/mL1.12±0.1313.51阳性(HCG)对照组1U/mL1.57±0.04**26.63空白对照组-1.02±0.0210.59

注：与空白组相比，*P<0.05，**P<0.01。

4 讨论

睾丸间质细胞分布于生精小管的结缔组织中，主要具有合成和分泌睾酮的功能，其分泌睾酮的形式有基础分泌和促性腺激素诱导分泌两种。睾酮对于人类生长发育、促进性欲以及精子的生成进而提高生育力等都具有十分重要的作用。鉴于睾酮在增强人体力量、性欲、免疫等功能的重要影响，且95%的血浆睾酮是由睾丸Leydig细胞分泌的[14]，故海狗丸的壮阳生精活性与睾丸间质细胞的增值和睾酮分泌密切相关。研究采用体外培养睾丸间质细胞，应用不同给药浓度的海狗丸样品处理，观察对睾丸间质细胞基础分泌的变化和对细胞增殖情况的影响。

通过建立体外培养大鼠 Leydig 细胞的原代培养方法，以MTT法考察海狗丸对Leydig细胞的增殖作用，以ELISA方法检测海狗丸对细胞培养上清液中睾酮含量的影响，来考察海狗丸的体外壮阳生精活性。实验结果显示，在设计剂量范围内，随着给药浓度的增加，对大鼠睾丸间质细胞增殖的促进作用逐渐增强，其低(50 μg/mL)、中(100 μg/mL)给药浓度的海狗丸样品与空白对照组相比没有统计学差异(P<0.05)，而高浓度(200 μg/mL)给药时就存在极显著统计学差异(P< 0.01)。此外，细胞培养上清液中睾酮的含量也随给药浓度的增加逐渐增加，且与空白对照组相比，100 μg/mL、200 μg/mL给药浓度时有统计学差异(P< 0.05)。由实验结果可知，一定浓度的海狗丸细胞给药后能促进睾丸间质细胞的增值和睾酮(T)的分泌，给药浓度的增大其促进作用也越明显。结果可知，海狗丸产品确实有一定的壮阳生精活性，为海狗丸的药效研究提供参考和实验支持。