TGFβ1对三阴性乳腺癌间质样干细胞表型及肝转移的作用研究

张晨静 屠江锋 耿晓歌 高惠琴 王婧雅 潘文胜⋆

三阴性乳腺癌（TNBC）是指雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体2（Her-2）均为阴性的乳腺癌，占全部乳腺癌的10%～20%［1］。其具有恶性程度高、对化疗不敏感、易复发转移、预后差等特点［2］。研究发现，实体肿瘤中存在一小群具有自我更新能力及多向分化潜能的肿瘤干细胞，不仅与肿瘤的发生发展及侵袭转移密切相关，且是肿瘤逃避常规治疗手段，导致耐药复发的原因［3］。转化生长因子β（TGFβ）是一种多向性、多效性的细胞因子，以自分泌或旁分泌的方式通过细胞表面的受体信号转导途径参与细胞的增殖、分化、凋亡等调控［4］。研究表明TGFβ配体及其信号通路在多能干细胞的干性维持中发挥了重要作用［5］。本文探讨TGFβ1对三阴性乳腺癌间质样细胞表型的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 乳腺癌细胞系SUM159，MDA-MB231及SCP2细胞培养于含10%胎牛血清（FBS）的DMEM高糖细胞培养基中，恒温培养箱中以37℃、5%CO2培养。

1.2 细胞形态观察 取对数生长期的乳腺癌细胞MDA-MB231，接种于6孔板中，接种密度为1×105细胞/孔。加入10ng/ml TGFβ1处理24h，光镜下观察细胞形态，拍照。

1.3 荧光定量PCR KRT8：上游引物序列为：5'CTAGGTGCGCGGATGGAAAT 3'；下游引物序列为：5'AGGTGGACACCTTGTAGGACT 3'。 KRT18：上游引物序列为：5' GATCATCGAGGACCTGAGGG 3'；下游引物序 列为：5' GTGTCATCAATGACCTTGCGG 3'。ACTA2： 上 游 引 物 序 列 为 ：5'TCGCATCAAGGCCCAAGAAA 3'；下游引物序列为：5'TTGTCACACACCAAGGCAGT 3'。KRT14：上游引物序列为：5' AGAACCTCAATGACCGCCTG 3'；下游引物序列 为 ：5' GTCCACTGTGGCTGTGAGAA 3'。GAPDH：上游引物序列为：5' TGGCCAAGGTCATCCATGAC 3'；下游引物 序列为：5' TGTCATACCAGGAAATGAGCTTG 3'。采用SsoFast™ EvaGreen® Supermix（美国Bio-rad公司）染料法行RT-PCR扩增。以GAPDH为内参，校正每个样本的Ct，计算△ct值，以2-△△ct计算基因表达。

1.4 Western-blot MDA细胞中加入细胞裂解液提取细胞蛋白，BCA蛋白定量试剂盒（美国Pierce公司）测定蛋白浓度后，取30g样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，应用电转仪将样品转移至聚偏二氟乙烯膜，5%脱脂奶粉封闭60min，加入小鼠抗人 CyclinD1单克隆抗体一抗（1：1000，美国abcam公司）。4℃孵育过夜，洗膜后加入相应的羊抗小鼠IgG二抗（1：5000）室温孵育120min，洗膜后化学发光 ECL法（美国Millipore公司）显影，暗室曝光。以小鼠抗人β-actin（1：5000，美国CST公司）作为内参阳性对照。

1.5 动物实验 实验裸鼠由上海实验动物中心提供，雌性，3～4周，SPF级环境中饲养。取2×106乳腺癌与Matrigel（BD公司）混合悬液注射至裸鼠第二对乳房垫中，建立乳腺癌肝转移模型。4～5周左右处死小鼠，取出小鼠肝脏，肉眼观察乳腺癌白色转移灶，后取部分肝脏组织用10%多聚甲醛固定。

1.6 HE染色 肝脏组织经过多聚甲醛固定24h后，脱水、石蜡包埋、切片、组织脱蜡，苏木素染液染核4 min，浸入自来水中1 min，0.5%盐酸酒精分化，自来水冲洗1min，0.5%氨水返蓝，自来水冲洗1min，伊红胞浆染色1min，蒸馏水洗1min，乙醇脱水，二甲苯I透明 10min，二甲苯II透明 10min，用中性树胶封片。

1.7 免疫组化染色 石蜡切片经脱蜡、抗原修复，血清封闭置于37℃孵育30min，分别于小鼠抗人CyclinD1单克隆抗体一抗，兔抗人CDK4单克隆抗体一抗及兔抗人RB单克隆抗体一抗（美国abcam公司）4℃孵育过夜，PBS洗3次，二抗37℃孵育30min，PBS洗3次，加SABC后37℃孵育30min，PBS洗3次后加入显色剂，将显色后的片子置于水中冲洗后，浸于苏木精中染色30s，脱水，封片。

1.8 统计学方法 采用 SPSS18.0 统计软件。计量资料比较用t检验。以 P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TGFβ1促使三阴性乳腺癌间质样干细胞表型改变情况 TGFβ1使细胞进一步呈现长梭样改变（见图1A）。伴随着细胞形态的改变，乳腺癌腺导管上皮标志物 KRT8 及 KRT18 表达下降，而间质/肌上皮标志物 KRT14 及 ACTA2 表达上调（见图1B）。同时，western-blot研究发现，TGFβ1组SUM159中干性转录因子NANOG表达上调（见图1C），提示 TGFβ1促进三阴性乳腺癌间质样干细胞表型进一步发生改变。

2.2 TGFβ1通过上调cyclinD1/CDK4通路促进三阴性乳腺癌间质样改变 经过TGFβ1处理24h后，三阴性乳腺癌细胞SUM159中cyclinD1、CDK4、RB表达上调（见图2A）。RT-PCR 对乳腺癌相关标志物分析发现，TGFβ1可以提高 KRT14 及 ACTA2 的表达，而降低 KRT8及KRT18基因的表达。而加入CDK4 抑制剂后这种作用被阻断（见图2B），提示cyclinD1/CDK4通路为TGFβ1促进并维持三阴性乳腺癌间质样干细胞表型所必须。

图1 TGFβ1促使三阴性乳腺癌间质样干细胞表型情况

A：western-blot检测对照组（ctrl）及TGFβ1组（TGFβ1）cyclinD1、CDK4、RB及内参表达；B：RT-PCR对乳腺癌相关标志物分析

2.3 TGFβ1诱导的乳腺癌间质样干细胞表型促进裸鼠乳腺癌肝脏转移 为进一步研究TGFβ1诱导的乳腺癌间质样干细胞表型在裸鼠乳腺癌肝转移中的作用，将对照组及经过TGFβ1反复处理的乳腺癌MDA细胞注射到裸鼠第二对乳房垫中，建立乳腺癌肝转移模型。4～5周左右处死小鼠，取出小鼠肝脏，并观察乳腺癌白色转移灶。结果显示，与接种对照组MDA细胞（Ctrl）的裸鼠相比，接种TGFβ1反复处理组MDA细胞（TGFβ1）的裸鼠乳腺癌肝脏转移灶显著增加（见图3A）。图3B显示为乳腺癌肝转移灶HE染色。免疫组化显示TGFβ1反复处理组乳腺癌肝脏转移灶中cyclinD1表达上调（见图3C）。

图3 TGFβ1诱导的乳腺癌间质样干细胞表型促进裸鼠乳腺癌肝脏转移

3 讨论

三阴性乳腺癌占所有乳腺癌类型的10%，近年来研究发现三阴性乳腺癌中富含肿瘤干细胞，对传统放化疗不敏感，预后差，因此受到了医学界的广泛关注。前期研究发现，三种乳腺癌细胞SUM159、MDA及SCP2中CD44+CD24-含量较高，而CD44+CD24-干细胞多分布于侵袭性肿瘤边缘，具有间质样细胞形态，与细胞的局部侵袭乃至转移密切相关［6］。近期研究表明TGFβ1配体及其信号通路在多能干细胞的干性维持中发挥重要作用。

为了进一步研究TGFβ1对乳腺癌间质样细胞表型的作用及其机制，在本实验中，应用TGFβ1 反复处理三种乳腺癌细胞SUM159、MDA及SCP2，并观察细胞形态的变化。结果发现，TGFβ1促使三阴性乳腺癌细胞进一步间质样改变。进一步研究发现TGFβ1通过上调cyclinD1/CDK4促进三阴性乳腺癌间质样改变。细胞周期素D1（cyclinD1）属于细胞周期正调控因子，研究发现cyclinD1在多种肿瘤中存在扩增及过度表达的现象，cyclinD1的过度表达常导致CDK4对视网膜母细胞瘤易感因子（Rb）的调节障碍，使其处于持续磷酸化状态，释放大量的生长调节因子E2F，导致细胞异常增殖［7-8］。而本实验发现cyclinD1/CDK4通路在TGFβ1诱导的三阴性乳腺癌间质样干细胞表型变化中也发挥重要作用。

本实验在乳腺癌裸鼠转移模型中进一步验证发现，TGFβ1诱导的三阴性乳腺癌间质样改变促进了乳腺癌肝脏转移灶的数量，免疫组化染色进一步验证了TGFβ1预处理组裸鼠肝转移灶中cyclinD1阳性染色增加。这些结果提示TGFβ1通过上调cyclinD1/CDK4通路促进三阴性乳腺癌间质样干细胞表型改变。同时，TGFβ1诱导的三阴性乳腺癌间质样干细胞表型改变促进了裸鼠乳腺癌肝脏转移。