SIRT1活化对TGF-β1诱导的足细胞ILK PCNA的影响

时延朋 杨汝春⋆ 张华琴 万凤

肾小球足细胞是一种高度分化的上皮细胞，与毛细血管内皮细胞、基底膜共同构成肾小球滤过屏障，在外界各种损伤因素刺激下，足细胞的结构和功能发生改变，肾小球滤过屏障遭受破坏，从而引发蛋白尿［1-2］，若不及时治疗则会导致肾小球硬化，最终导致肾脏衰竭。转化生长因子-β1（transforming growth factor-beta，TGF-β1）是一种诱导足细胞转分化的细胞因子，也是引起肾脏纤维化、肾小球硬化的主要诱导因子之一［3］。整合素连接激酶（ILK）与增殖细胞核蛋白（PCNA）在正常肾组织中表达水平均较低，而在肾小球足细胞表型发生转分化时则表达上调。2016年6月至2017年12月作者通过实验研究探讨，沉默信息调控因子1（Silent information regulator 1，SIRT1）对肾小球足细胞表型的影响机制。

1 材料与方法

1.1 主 要 试 剂 RPMI1640（GIBCO）， 胎 牛 血 清（GIBCO），重组鼠干扰素γ（Recombinant Murine interferon-γ，γ-IFN，美国Peprotech Inc，315-05），Recombinant Human TGF-β1（ 美 国 Peprotech Inc，100-21），SRT1720（Selleck，016025），兔抗 α-SMA（EPIC MICS，YH090708D），ILK（Santa-Cruz，sc-20019），PCNA（Santa-Cruz，sc-56），鼠抗 GAPDH（达文生物，DW880543），IR Dye 800CW Goat Anti-Rabbit（C60107-06）；IR Dye 680LT Goat Anti-mouse（C51007-05），CCK-8（Dojindo，CK04）。

1.2 方法 （1）细胞培养及分化：永生化温度敏感小鼠足细胞株由Mundel教授惠赠，浙江省儿童医院毛建华教授转赠。将复苏的足细胞用含有γ-干扰素（γ-IFN）100U/ml和10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养，置33℃、5%CO2培养箱中孵育，让细胞增殖传代。诱导分化时，将培养液换成不含γ-IFN的培养基培养，并转移至37℃、5%CO2培养箱中培养2周。（2）细胞分组：将分化成熟的足细胞分为正常组、模型组、白藜芦醇组（5μM）和SRT1720-2μM、SRT1720-1μM组。细胞干预前换含2%胎牛血清的RPMI1640培养液，模型组用2ng/ml的TGF-β1刺激72h，白藜芦醇组和SRT1720-2μM组、SRT1720-1μM组分别先加白藜芦醇至5μM、SRT1720至2μM和1μM干预30min，然后用2ng/mlTGF-β1刺激72h。（3）Western-blot技术检测蛋白表达丰度：去除细胞培养液，用预冷的PBS洗2次，加入RIPA细胞裂解液，收集样本，低温离心，取上清液，用BCA法测蛋白浓度。取蛋白进行聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳分离蛋白，转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2h，加入一抗，4℃过夜；去一抗，PBST缓冲液洗3次，再加入相应的荧光二抗，室温孵育1.5h；PBST缓冲液洗6次，通过Odyssey CLx近红外双色荧光成像系统显影并分析结果。（4）CCK-8法检测细胞存活率：将足细胞以2000个/孔接种于96孔板，按照实验分组给予不同药物作用，培养72h后，每孔加入10μl CCK-8溶液，将培养板置于37℃、5%CO2培养箱中培养2h，用酶标仪在450nm处测定OD值。

1.3 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件。计量资料用（±s）表示，多组间采用one-way ANOVA检验，组间两两比较用LSD法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TGF-β1对足细胞存活率的影响 TGF-β1各剂量组与正常组比较，差异无统计学意义。见表1。

表1 TGF-β1对足细胞存活率的影响（±s）

表1 TGF-β1对足细胞存活率的影响（±s）

组别 n 存活率（%）正常组 5 100.0±2.7 TGF-β1（2ng/ml）组 5 104.2±10.0 TGF-β1（5ng/ml）组 5 98.3±8.0 TGF-β1（10ng/ml）组 5 94.3±6.3

2.2 白藜芦醇和SRT1720对足细胞存活率的影响 白藜芦醇组和SRT1720各剂量组与正常组比较，差异无统计学意义。见表2。

表2 白藜芦醇和SRT1720对足细胞存活率的影响

2.3 白藜芦醇和SRT1720对TGF-β1刺激的足细胞存活率的影响 除正常组外，其余各组用TGF-β1刺激，经白藜芦醇和SRT1720干预后足细胞存活率降低，且与TGF-β1组比较差异有统计学意义（P＜0.05），SRT1720-2μM和SRT1720-1μM组降低更加明显。见表3。

2.4 白藜芦醇和SRT1720对TGF-β1刺激的足细胞PCNA的影响 足细胞经TGF-β1刺激后PCNA蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），而白藜芦醇和SRT1720干预则能够逆转上述变化，使足细胞PCNA蛋白表达量降低（P＜0.05）。见表4、图 1。

表4 白藜芦醇和SRT1720对TGF-β1刺激的足细胞PCNA的影响

图1 各组PCNA/GAPDH比较

2.5 白藜芦醇和SRT1720对TGF-β1刺激的足细胞ILK的影响 与正常组比较，TGF-β1组足细胞ILK蛋白表达明显上调（P＜0.05）；经白藜芦醇和SRT1720干预后足细胞ILK蛋白表达下降（P＜0.05）。见表5、图2。

表5 白藜芦醇和SRT1720对TGF-β1刺激的足细胞ILK的影响

图2 各组ILK/GAPDH比较

2.6 白藜芦醇和SRT1720对TGF-β1刺激的足细胞α-SMA的影响 正常足细胞在TGF-β1刺激后α-SMA蛋白表达量升高（P＜0.05），白藜芦醇和SRT1720干预后α-SMA蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05）。见表 6、图 3。

表6 白藜芦醇和SRT1720对TGF-β1刺激的足细胞α-SMA的影响

图3 各组α-SMA/GAPDH比较

3 讨论

肾小球足细胞位于肾小球基底膜的外侧，由胞体、主突、足突组成，是构成肾小球滤过屏障的重要组成部分。TGF-β1是一种多功能的细胞调节因子，能够诱导肾小球足细胞发生上皮细胞向间充质细胞转化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT），导致细胞表型发生改变［2，4］，肾小球滤过屏障遭到破坏。本实验结果显示当足细胞经TGF-β1诱导后，存活率有所增加，可能与足细胞转分化以后，细胞表型改变，产生新的亚型，导致其异常增殖有关。经白藜芦醇和SRT1720干预后，足细胞存活率下降，推测因SIRT1被激活，从而抑制TGF-β1诱导的足细胞转分化，细胞异常增殖情况得到改善。

ILK是一种新发现的粘附蛋白，具有多种生物学活性，为间充质细胞标志蛋白，与足细胞表型改变密切相关，在调节细胞周期、基质积聚、肿瘤发生［5-6］、维持肾小球基底膜的完整性、保持肾小球的滤过功能和防止蛋白质的漏出中起重要作用［7］。PCNA又称周期蛋白（cyclin），是一种仅在增殖状态细胞核内出现的非组蛋白型核蛋白质［8］，其在成年大、小鼠肾小管、集合管和肾小球中有少量细胞表达［9-10］。研究表明PCNA在增殖细胞中的含量变化有明显的周期性，可反映细胞增殖活性、判断细胞增殖状况，是细胞增殖程度的可靠指标［11］。本资料显示，当足细胞经TGF-β1诱导后，ILK和PCNA蛋白的表达显著升高，且间充质细胞标志蛋白α-SMA的表达也上调，提示TGF-β1成功诱导肾小球足细胞转分化，足细胞已失去原有的形态结构和功能，细胞异常增殖活性升高。

白藜芦醇和SRT1720是公认的SIRT1激活剂，且SRT1720的激动效果比白藜芦醇强1000倍［12］。研究显示，白藜芦醇和SRT1720能够减少蛋白尿和足细胞损伤，具有明显的肾脏保护作用［13-14］。本资料中，白藜芦醇和不同剂量的SRT1720对TGF-β1诱导的肾小球足细胞干预后，ILK和PCNA蛋白表达显著降低，且对SRT1720具有剂量依赖性，同时白藜芦醇和SRT1720还可降低间充质细胞标志蛋白α-SMA的表达，这表明SIRT1激活剂能够显著抑制TGF-β1诱导的肾小球足细胞转分化，降低细胞的异常增殖，对肾小球足细胞具有明显的保护作用。且5μM白藜芦醇和1-2μM SRT1720对足细胞的存活率无显著影响，提示其对正常足细胞无显著毒副作用。

综上所述，白藜芦醇和SRT1720激活SIRT1对TGF-β1诱导的肾小球足细胞转分化具有显著抑制作用，SIRT1活化可能是纠正足细胞病理形态改变、维持足细胞正常表型、防治蛋白尿发生的重要分子靶点。