响应面法优化白刺花中总氨基酸的提取工艺研究

兰慧 阳敬

【摘 要】 目的：优化白刺花中总氨基酸的最佳提取工艺。方法：采用响应面分析法，以总氨基酸提取率为评价指标，在考察单因素试验的基础上，选取乙醇浓度、加液量、提取温度和提取时间为自变量，利用Design-Expert软件分析优化出白刺花中总氨基酸的最佳提取工艺条件。结果：优化所得白刺花中总氨基酸的最佳提取工艺条件为：乙醇浓度为58%，加液量为21倍，提取温度为69℃，提取时间为131 min。结论：响应面优化所得到的最佳提取工艺准确、稳定，是提取白刺花中总氨基酸的可行方法。

【关键词】 白刺花；总氨基酸；提取工艺；响应面法

【中图分类号】R284.2 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2018）13-0018-07

Abstract：Objective Optimize the extraction technology of total amino acid from Sophora viciifolia hance.Methods Response surface models was used to optimize the extraction technology of total amino acid from Sophora viciifolia hance.The total amino acid were extracted using ultrasonic assisted ethanol extraction.On the basis of single factor， the concentration of ethanol， the amount of liquid added， the extraction temperature and the extraction time were the independentvariables.Design-Expert response surface methodology was employed for selecting the optimum extraction process by the indexes of the contents of total amino acid from Sophora viciifolia hance.Results Total amino acid from Sophora viciifolia hance of optimum extraction conditions were as follows，58% of the ethanol concentration，21 times of the amount of liquid added，extraction temperature of 69℃，extraction time 131min. Conclusion The extraction process obtained by response surface methodology was stable and reasonable，accurate and reliable. It was a feasible method to extract the total amino acid from Sophora viciifolia hance.

Keywords：Sophora Viciifolia Hance；Total Amino Acid；Extraction Process；Response Surface Methodology

白刺花又名苦豆花、狼牙刺，在南方各地均有大量分布[1]，其花為汉族民间及少数民族习用，在民间有广泛的用药基础和丰富的药物资源[2]，同时也是药食两用之品[3]。白刺花有清热利咽、凉血消肿等作用，主治咽喉肿痛、便血、肺热咳嗽、痢疾、淋证、水肿、衄血、尿血等；花有清热解暑作用，用于暑热烦渴作用[4]。此外白刺花还含有大量的营养成分，如多种氨基酸等[5]。基于白刺花良好的药食两用用价值，笔者欲将野生白刺花开发成为保健速溶茶，现通过实验研究，优化出白刺花中总氨基酸的最佳提取方法，为白刺花保健速溶茶的开发提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 A580型双光束紫外可见分光光度计（翱艺仪器有限公司）；ML204分析天平（上海亚荣仪器有限公司）；FA2004电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；101型电热鼓风干燥箱（北京市永光明医疗仪器有限公司）；HH-4 型恒温水浴锅（常州润华电器有限公司）；DLF-18型流水式中药粉碎机（温州顶历医疗器械有限公司）；RE-3000A 型旋转蒸发器（上海亚荣仪器有限公司）。

1.2 材料 甘氨酸对照品（分析纯，批号：130518，中国新型化工试剂研究所）；苯骈戊三酮（茚三酮，分析纯，批号：20110414）；磷酸盐缓冲溶液（pH=6.8，实验室配制）；白刺花采自红河州豆科小灌木植物白刺花的花；所用到的其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 含量测定方法

2.1.1 茚三酮溶液的制备 精密称取茚三酮约0.5g 置于25 mL 量瓶中，加适量无水乙醇溶解后定容成2%的茚三酮溶液，冰箱冷藏备用。

2.1.2 对照品溶液的制备[6-7] 精密称取干燥至恒重的甘氨酸对照品5.000 mg置于50 mL容量瓶中，加适量蒸馏水溶解后，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，即得（每毫升标准品溶液含甘氨酸0.1 mg）。

2.1.3 测定波长的选择[8] 精密量取对照品溶液2 mL，置10 mL 量瓶中，加入茚三酮溶液1 mL，再加入磷酸盐缓冲液（pH=6.8）2 mL，摇匀，水浴锅上加热15 min，冷却，用蒸馏水稀释至刻度，以空白试剂作参照，于波长400～600 nm范围内扫描，569 nm波长处有一最大吸收峰，故选择569 nm为测定波长。

2.1.4 标准曲线的绘制 精密移取对照品溶液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 mL 于 10 mL 量瓶中，按“2.1.3”项下方法显色后，选择569 nm波长，用空白试剂做参照，测定6种溶液的吸光度值。以浓度（X）为横坐标，吸光度（Y）为纵坐标，得线性回归方程Y=76.243X-0.0041，R2=0.9998，对照品溶液浓度与吸光度在0.002～0.012 mg/mL 范围内线性关系良好。

2.1.5 供试品溶液的制备 将白刺花原料粉碎，过60目筛，取粗粉过的白刺花5 g，按实验设定的条件进行提取，提取液减压抽滤，滤液定容至100 ml，即得供试品溶液。

2.1.6 样品中总氨基酸的含量测定 精密量取2 ml供试品溶液置于10 ml容量瓶中，按“2.1.3”项方法测定吸光度，计算总氨基酸提取率。

总氨基酸的提取率（%）=C×V1×V3×100V2×m

式中：C 为提取总氨基酸的质量浓度，mg/mL；V1为测量液定容体积，10 mL；V2为测量时量取的体积，2 mL；V3为提取液定容体积，100mL；m为称取样品的质量，5000 mg。

2.2 方法学考察

2.2.1 精密度试验 分别精密移取对照品溶液2mL和供试品溶液2 mL，分别于569 nm波长处以空白溶剂为对照，按2.1.3项方法测定吸光度（n=6），结果对照品溶液吸光度的RSD=0.16% ，供试品溶液的RSD=0.23%，表明该试验方法精密度良好 。

2.2.2 稳定性试验 精密移取供试品溶液2 mL，按“2.1.3”项方法，分别于 0、30、60、90、120、150、180测定吸光度，结果样品溶液显色后180min内吸光度的RSD=1.37% ，表明供试品溶液显色稳定。

2.2.3 重复性试验 取同一批次药材，按“2.1.5”项下方法制备供试品溶液，精密移取该供试品溶液2 mL，按2.1.3项下方法测定各供试品溶液的吸光度（n=6），并计算出各供试品溶液中总氨基酸的含量，其RSD=0.19%，表明该方法重复性良好。

2.2.4 加样回收率试验 取已知含量的白刺花药材粗粉5 g，精密称定，平行 6份，按2.1.5项下方法制备供试品溶液，精密量取各供试品溶液2 mL置于10 mL容量瓶中，在各容量瓶中分别加入1、2、3、4、5、6 mL的甘氨酸标准品溶液（甘氨酸标准品溶度为0.1 mg/mL），按2.1.3项下方法测定各供试品溶液的吸光度，计算各供试品溶液中总氨基酸的含量，并计算各供试品溶液中总氨基酸的回收率，结果平均回收率为99.91%，RSD=0.72%，表明该试验方法回收率良好。

2.3 单因素考察

2.3.1 加液量对白刺花中总氨基酸提取率的影响 固定白刺花中总氨基酸提取时的乙醇浓度为60% ，时间为1.5h（90min），温度为80℃ 等试验因素，考察加液量为5倍、10倍、15倍、20倍、25倍情况下所提取的总氨基酸的变化。由图2得知，白刺花中总氨基酸的提取率随加液量倍数的增大而增高，但加液量为20倍与加液量25倍比较，总氨基酸的提取率雖然有所提高，但提高值不大，从生产角度出发，加液量到25倍，意义不大。

2.3.2 提取时间对白刺花中总氨基酸提取率的影响 固定白刺花中总氨基酸提取时的加液量为20倍，乙醇浓度为 60% ，温度为 80 ℃等试验因素，考察时间分别为1、1.5、2、2.5、3 h情况下所提取的总氨基酸的变化。由图3得知，白刺花中总氨基酸的提取率在提取时间为2 h时最高，此时提取时间继续延长，提取率反而下降，故提取时间为2h时对白刺花中总氨基酸的提取较为理想。图中也可反应出提取时间过长，白刺花中氨基酸成分会被破坏。

2.3.3 乙醇浓度对白刺花中总氨基酸提取率的影响 固定白刺花中总氨基酸提取时的加液量为20倍，时间为2 h，温度为80 ℃，考察乙醇浓度分别为40%乙醇 、50%乙醇 、60%乙醇 、70%乙醇 、80%乙醇情况下所提取的总氨基酸的变化。从图4得知，在乙醇浓度为60%以后，总氨基酸的提取率在呈下降趋势，即当乙醇浓度为60%时，总氨基酸的提取率达到最高。

2.3.4 提取温度对白刺花中总氨基酸提取率的影响 固定白刺花中总氨基酸提取时加液量为20倍，时间2 h，乙醇浓度为60%，考查温度分别为40、50、60、70、80、90℃情况下所提取的总氨基酸的变化。从图5得知，随着温度升高，白刺花中氨基酸提取率在增高，当温度达到70 ℃ 时，白刺花中总氨基酸提取率达到最高。

2.4 响应面法优化白刺花中总氨基酸提取工艺 在单因素试验的基础上，选择乙醇浓度（A）、加液量（B）、提取温度（C） 和提取时间（D）为考察因素，利用 Design-Expert8.0.6软件中的 Box-Behnken 软件对白刺花中总氨基酸提取条件进行优化。以白刺花总氨基酸提取率为响应值，进行响应面分析试验[9-10]，以乙醇浓度（A）、加液量（B）、提取温度 （C） 和提取时间 （D）为自变量，以总氨基酸提取率为响应值（Y） 进行实验设计，各因素水平设计见表2。白刺花Box-Behnken中心组合试验设计和结果见表3。

采用Design-Expert8.0.6软件分析试验结果，以总氨基酸的提取率为响应值，对实验数据进行二次多项式回归拟合，得回归方程为：Y=0.62-0.011A+0.010B-0.013C+0.033D-4.500E-003AB-6.000E-003AC-0.016AD+0.013BC+0.012BD-5.000E-004CD-0.041A2-0.031B2-0.040C2-0.055D2

使用Design-Expert 8.0.6软件对方程及各因子进行方差分析，分析结果见表4。由表4可知，以白刺花的总氨基酸的提取率为响应值，回归方程显著性检测 P﹤0.0001，表明所得二次方程模型极显著，而失拟项的P值为0.2445，不显著，R2=0.9713，表明回归方程模型与实际实验拟合性比较好，试验误差较小，说明采用响应面法优化白刺花中总氨基酸提取工艺是可行的，具有参考性[11]，其中各影响因素对白刺花总氨基酸提取率的影响顺序为：提取时间>提取温度>乙醇浓度>加液量。