亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与不良妊娠结局的关系

梅瑾 卢莎 王昊 陈益明 王小华

不良妊娠结局包括流产、死胎、早产、胎儿畸形及先天性出生缺陷等，严重影响人口健康素质和社会经济发展。目前关于不良妊娠结局的原因尚不十分清晰，有研究表明遗传因素与其有关，并涉及到相关基因的突变[1]。近年来，与叶酸代谢密切相关的亚甲基四氢叶酸还原酶（5,10-Methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）的单核苷酸多态性与自然流产、出生缺陷、肿瘤性疾病的关系也被越来越多的学者所研究[2-4]。本研究通过检测不良妊娠结局患者与正常人群外周静脉血基因组DNA MTHFR基因位点的多态性，分析MTHFR基因突变与出生缺陷及自然流产的相关性，为降低不良妊娠结局发生率制定个性化干预措施提供循征医学证据。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2014年4月至2016年4月来本院就诊的曾有不良妊娠结局的育龄期妇女242例为研究组，不良妊娠结局类型包括自然流产、胚胎停育、神经管缺陷、无脑儿、脑积水、脑瘫、染色体病、先天性智力低下、先天性心脏病、唇腭裂、四肢畸形等。选取同期来院就诊的无不良妊娠史的育龄期妇女339例为对照组。入选标准：（1）妇科检查、B超检查等已排除生殖系统解剖畸形；（2）无甲状腺功能亢进/减退、糖尿病等内分泌相关疾病；（3）TORCH检测IgM阴性；（4）抗磷脂相关抗体、自身抗体、抗精子抗体等生殖免疫抗体均为阴性；（5）ABO及Rh血型无溶血；（6）无家族性遗传病史；（7）无恶性肿瘤及其他全身性疾病。研究组年龄19～40（29.52±3.79）岁，BMI（22.68±2.17）kg/m2；对照组年龄 20～40（29.79±5.11）岁，BM（I22.76±2.59）kg/m2；两组对象年龄和BMI比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。本研究经医院伦理委员会批准和患者知情同意。

1.2 标本采集 抽取受检者外周静脉血2ml，加入含乙二胺四乙酸抗凝剂的采血管内混匀。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 从外周静脉血中提取DNA，所用的DNA微量样本基因组提取试剂盒购于德国罗氏公司（批号23655500），操作步骤按照试剂盒说明书进行。为了保证实验结果的准确性，以健康者外周血及无核酸蒸馏水为阴性对照和空白对照。

1.3.2 MTHFR基因检测 采用荧光定量PCR法分析MTHFR基因C677T和A1298C两个位点单核苷酸多态性的基因型，所用仪器为Light Cycler480（德国罗氏公司）。实验反应体系中探针工作液2μl、引物工作液1μl、5X LightCycler master mix 4μl、分子级无菌水 10μl、DNA 3μl。扩增循环条件：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性 5s，57℃退火 10s，72℃延伸 15s，45 个循环；反应结束后通过Light Cycler480的 Gene Scanning软件（1.5 version）对熔解曲线进行分析，溶解曲线条件：95℃维持1min，45℃维持1min，从45℃以0.14℃/s的升温速率升温至68℃，并且在此阶段采集荧光信号。每次检测同时带有3个标准品、2个阳性对照及1个阴性对照。采用双盲法对所有样本进行分型，并从所有样本中随机抽取10%的样本进行重复验证。

表2 两组A1298C位点基因型和等位基因频率分布[例（%）]

表1 两组C677T位点基因型和等位基因频率分布[例（%）]

1.4 统计学处理 采用SPSS 20.0统计软件。两组MTHFR C677T和A1298C两个位点的基因型频率分布比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究组不良妊娠结局分析 胎儿染色体病（包括21-三体、18-三体、13-三体等三体染色体病及单体染色体病、性染色体病）56例（23.2%），神经系统异常（包括神经管缺陷、无脑儿、脑积水、脑瘫、先天性智力低下等神经系统异常相关疾病）25例（10.3%），先天性心脏病25例（10.3%），四肢畸形 4例（1.7%），唇腭裂1例（0.4%），不明原因流产或胚胎停育131例（54.1%）。

2.2 两组C677T位点基因型和等位基因频率分布 研究组C677T位点的CC野生纯合型频率低于对照组，TT突变纯合型频率高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；而两组CT突变杂合型频率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。两组C、T等位基因频率比较差异有统计学意义（P＜0.01），见表 1。

2.3 两组A1298C位点基因型和等位基因频率分布研究组A1298C位点的AA野生纯合型频率低于对照组，CC突变纯合型频率高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；而两组AC突变杂合型频率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。两组A、C等位基因频率比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

2.4 两组C677T和A1298C联合基因型频率分布比较本研究进一步分析了MTHFR的C677T和A1298C两个位点的联合基因型频率分布，结果显示研究组CC/CC、CT/CC、TT/AC联合基因型频率显著高于对照组，而CC/AA和CT/AA联合基因型频率显著低于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表3。

表3 两组C677T和A1298C联合基因型频率分布比较[例（%）]

3 讨论

叶酸是体内重要的甲基供体，叶酸代谢途径的正常运转对于维持DNA正常甲基化、DNA从头合成以及DNA修复至关重要。MTHFR基因编码的蛋白质转化5，10亚甲基四氢叶酸为5甲基四氢叶酸，为机体的正常甲基化过程提供甲基基团。MTHFR基因位于人类染色体1p36.3，编码656个氨基酸，包括11个外显子和10个内含子[3]，MTHFR基因编码MTHFR蛋白，是叶酸代谢的关键酶。该基因具有高度保守性，目前研究已经发现MTHFR基因有近20种基因多态性突变位点，其中最具有临床意义的两个突变位点是C677T和A1298C。C677T突变表现为3种基因型，即CC、CT和TT型；A1298C突变表现为3种基因型，即AA、AC和CC型。

C677T位点突变的CT突变杂合型可使酶的活性下降35%，TT突变纯合型可使酶的活性下降70%，影响叶酸的正常代谢，进而导致DNA低甲基化，干扰DNA合成和DNA损伤修复，造成DNA链断裂、染色体重组改变和分离异常；同时可引起血管内皮细胞损伤和功能异常，激活血小板的黏附和聚集[5]，导致胎盘血栓性病变，被认为是不明原因流产的危险因素之一[6]。

孕妇对叶酸的需求量为常人的2～3倍，一旦MTHFR基因发生突变而导致其对叶酸的利用能力降低，容易导致胎儿神经管畸形、唇腭裂、唐氏综合征、自发性流产、胎儿宫内发育迟缓、早产及新生儿低出生体质量等叶酸代谢相关的疾病发生风险增高，还可造成孕妇妊娠期高血压疾病、胎盘早剥、贫血等妊娠并发症的发生[7]。

本研究表明两组C677T位点的CC型、TT型及A1298C位点的AA型、CC型频率比较差异均有统计学意义，而两组C677T位点的CT突变杂合型及A1298C位点的AC突变杂合型频率比较差异均无统计学意义。提示等位基因的纯合突变与不良妊娠结局可能有关，而等位基因的杂合突变与不良妊娠结局的影响在统计上不相关，这可能与杂合型突变使酶的活性下降不如纯合型明显有关。根据以上结果推测，MTHFR基因多态性是不良妊娠发生的遗传易感性因素，尤其是等位基因发生纯合突变会增加发生不良妊娠结局的风险。刘念等[8]研究发现，不良孕产史孕妇MTHFR基因C677T位点的TT型突变、A1298C位点的CC型突变基因频率均高于对照组，与本研究结果类似。王贤军等[9]研究发现，MTHFR基因C677T位点的TT突变纯合型可能为不明原因复发性流产的危险因素。安乐等[10]在探讨MTHFR基因多态性与先天性非综合型唇腭裂的发生关系中发现，单纯性唇腭裂以及唇裂伴或者不伴腭裂组C677T位点的T等位基因频率明显高于正常对照人群。

本研究进一步分析了MTHFR的C677T和A1298C两个位点的联合基因型频率分布，发现研究组CC/CC、CT/CC、TT/AC联合基因型频率显著高于对照组，而CC/AA和CT/AA联合基因型频率显著低于对照组，差异均有统计学意义。韦燕珍等[11]对柳州地区MTHFR基因多态性与不良妊娠结局的相关性分析发现，A1298C位点发生CC纯合突变和C677T位点发生TT纯合突变对不良妊娠结局的影响均显著，当两个位点均发生杂合突变时，对不良妊娠结局的影响不显著。本研究除了TT/AA这个基因型，其余与韦燕珍等[11]研究结果一致。本文研究对象均生活在杭州，饮食差异较小，生活习惯相近，环境影响差异小，研究结果可信度较高。

综上所述，有不良妊娠史的女性MTHFR基因C677T位点的TT突变纯合型、A1298C位点的CC突变纯合型频率均显著高于无不良妊娠史的妇女；而C677T位点的CC野生纯合型、A1298C位点的AA野生纯合型频率均显著低于无不良妊娠史的妇女，提示基因C677T和A1298C位点多态可能与不良妊娠结局有关。此外，两组在C677T和A1298C两个位点的联合基因型CC/CC、CT/CC、TT/AC比较差异均有统计学意义，提示上述联合基因型与不良妊娠结局密切相关。此类人群应进行叶酸代谢基因多态性检测，并针对检测结果做好相应的个性化干预措施。