活血降糖饮对肥胖大鼠摄食行为的调节作用及海马CD36表达的影响*

刘德亮 渠 昕△ 李惠林△ 赵恒侠 楚淑芳 庄伟坤 张学文

1深圳市中医院，广东深圳 5180332广州中医药大学第四临床医学院，广东深圳 5180333陕西中医药大学，陕西咸阳 712046

流行病学调查[1-2]结果显示，近年来我国肥胖、Ⅱ型糖尿病等代谢性疾病的发病率逐年增加，这与生活水平的提高，饮食结构的改变密切相关。行为学研究[3-4]发现人和动物对膳食脂肪均有较强的偏好。因此，若能调控摄食行为，控制对膳食脂肪的偏好，减少脂肪摄入，可延缓代谢性疾病的发生和进展[5]。活血降糖饮是本院协定处方，具有益气养阴、活血通络的作用；前期研究发现其具有良好的降糖、调脂及抑制β细胞凋亡等作用。方中含有大量性味苦寒、甘寒的益气养阴清热药物，按中医理论而言，其有滋腻碍胃之嫌，但可能发挥对摄食行为的调控作用。因此，本文对活血降糖饮干预的肥胖大鼠的摄食行为进行研究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物及饲养

SPF级雄性SD大鼠50只，体重180～220 g，由广东省医学实验动物中心提供。饲养环境：温度18～22℃，湿度40～70%，自由摄食、饮水，自然昼夜节律光照。常规饲料(热量构成为脂肪13%，蛋白质23%，碳水化合物64%)及高脂饲料(热量构成为脂肪60%，蛋白质20%，碳水化合物20%)均购于广东省医学实验动物中心。

1.2 药物及试剂

活血降糖饮(黄芪30 g，生地20 g，丹参30 g，太子参30 g，五味子15 g，麦冬15 g，山药12 g，黄精15 g，丹皮12 g，大黄16 g，红花12 g，桃仁10 g)蒸馏水浸泡2 h后，大火煎开，小火继续煎煮30 min，共2次，过滤浓缩为4 g/ml药液，4℃冰箱保存备用。盐酸二甲双胍片(中美上海施贵宝制药有限公司，国药准字H20023370)用蒸馏水溶解为浓度20 mg/ml药液，4℃储存。

1.3 试剂及仪器

总胆固醇(TC)、总三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)、血糖试剂盒购于南京建成生物工程研究所，游离脂肪酸(NEFA)试剂盒购自日本和光纯药工业株式会社，胰岛素放免试剂盒购于北京原子能科学研究所。兔抗大鼠CD36多克隆抗体、β-actin多克隆抗体购自Santa Cruz公司，蛋白抽提试剂盒及辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体购自武汉博士德生物公司。检测仪器包括北京六一仪器厂DYCZ-24型垂直板电泳槽等。

1.4 实验方法

1.4.1 动物模型和分组 经过1周的适应性喂养后，随机选出10只大鼠作为正常对照组，常规饲料喂养，自由进食和饮水。其余大鼠以高脂高热卡饮食喂养8周后，筛选出30只血脂及胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)异常的作为成模大鼠(根据以上指标计算95%可信区间，数据均高于正常范围上线20%认为模型成功)，将其随机分为模型组、中药组、二甲双胍组，每组10只。

1.4.2 动物处理 正常组和模型组以适量体积生理盐水灌胃，中药组以5 g/(kg·d)剂量灌服活血降糖饮，二甲双胍组以200 mg/(kg·d)剂量灌胃二甲双胍。正常组喂以常规饲料，其他组均继续喂以高脂高热卡饲料。各组干预8周后，进行双瓶喜好实验，检测大鼠对膳食脂肪的偏好。1周后，禁食24 h，腹腔注射45 mg/kg戊巴比妥钠麻醉后，腹主动脉采血，分离血清，检测血脂、游离脂肪酸、空腹血糖(FPG)、空腹胰岛素(FINS)；断头，取脑组织，冰上分离海马组织，经过液氮后保存于-80℃冰箱。

1.4.3 指标测量 ①按照说明书检测各血清学指标；②双瓶喜好实验：将标号、称重过的盛有纯水和20%亚油酸(LA)的200 ml饮水瓶，分别插入鼠笼笼盖左右两端(LA水在左，纯水在右)1 h，1 h后交换2瓶位置，再过1 h后将饮水瓶取下，称重；脂肪偏好度=[2h 20%亚油酸饮用量/(2h 20%亚油酸饮用量+2h纯水饮用量)]×100%；③western blot检测海马组织CD36蛋白表达：海马组织总蛋白提取按照蛋白抽提试剂盒说明书操作，考马斯亮蓝G-250测定蛋白浓度；10% SDS-PAGE凝胶电泳(各样品上样量均为50μg)，湿转法转膜后，封闭2 h，一抗4℃孵育过夜(抗体工作浓度为1∶1000)，次日经TBST洗膜后用二抗孵育2 h(二抗工作浓度为1∶5000)，进行杂交ECL化学发光，分析各条带的吸光度值，用蛋白/内参的比值表示各蛋白的表达量。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 活血降糖饮对大鼠体重的影响

模型组大鼠体重明显高于正常组，治疗后，中药组和二甲双胍组大鼠体重明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 各组大鼠体重比较

与正常组比较**P<0.01；与模型组比较△△P<0.01

2.2 活血降糖饮对大鼠FPG、FINS以及HOMA-IR的影响

模型组大鼠FPG、FINS、HOMA-IR均明显高于正常组；治疗后，中药组和二甲双胍组大鼠FPG、FINS、HOMA-IR均较模型组有不同程度降低，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。见表2。

表2 各组大鼠FPG、FINS及HOMA-IR比较

与正常组比较**P<0.01；与模型组比较△P<0.05，△△P<0.01

2.3 活血降糖饮对大鼠血脂水平的影响

与正常组比较，模型组大鼠TC、TG、LDL-c、NEFA均明显升高，HDL-c明显下降(P<0.01)；与模型组比较，中药组和二甲双胍组TC、TG、LDL-c、NEFA均有不同程度下降，差异有统计学意义(P<0.01)；而中药组和二甲双胍组HDL-c与模型组比较无明显变化(P>0.05)。见表3。

表3 各组大鼠血脂比较

与正常组比较**P<0.01；与模型组比较△△P<0.01

2.4 活血降糖饮对大鼠脂肪偏好度的影响

与正常组比较，模型组大鼠脂肪偏好度明显增加；与模型组比较，中药组和二甲双胍组脂肪偏好度明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)。见表4。

表4 各组大鼠脂肪偏好度

与正常组比较**P<0.01；与模型组比较△△P<0.01

2.5 活血降糖饮对大鼠海马组织CD36表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠海马组织中CD36蛋白表达明显增加；与模型组比较，中药组和二甲双胍组海马组织中CD36蛋白表达明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)。见图1。

A：正常组；B：模型组；C：中药组；D：二甲双胍组与正常组比较**P<0.01；与模型组比较△△P<0.01图1 各组大鼠海马组织CD36蛋白表达

3 讨论

摄食是人体维持生命的重要生理行为，过量摄取高脂高热卡饮食会增加代谢性疾病的发生[6]。根据《黄帝内经》中“未病先防，既病防变”的思想，可通过抑制对膳食脂肪的偏好控制高脂饮食的摄入量，从而预防代谢性疾病的发生和进展。

传统中医理论认为“胃气”与人的健康关系密切，而食欲由“胃气”决定。因此，注意顾护“胃气”，也就增加了食欲。对“胃气”的抑制，多出现在一些中药的不良反应中，比如滋阴药，大多“滋腻碍胃”。文献研究发现中药对食欲抑制有间接作用，比如Wang J等[7]学者证实了苦寒药和滋阴药有“碍胃”之嫌，在应用黄连生脉饮(黄连、黄芪、党参、麦冬、五味子、丹参、苦参、当归、酸枣仁)治疗早搏的过程中，患者出现食欲减退。中医多以“三消”理论指导治疗糖尿病，主要以益气养阴、活血化瘀为主，常应用滋腻碍胃的滋阴药和苦寒药。

本科室协定方活血降糖饮由黄芪、生地、丹参、太子参、黄精、五味子、麦冬、山药、丹皮、红花、桃仁、大黄等药物组成，具有益气养阴，清热泻浊，活血通络的功效，临床上用于治疗Ⅱ型糖尿病，治疗后患者多食易饥症状明显改善。本研究结果表明，经活血降糖饮治疗后，肥胖大鼠脂肪偏好明显降低，说明活血降糖饮对肥胖大鼠摄食行为中的饮食偏好具有调控作用。

CD36是一种完整的细胞膜糖蛋白，其在细胞表面和溶酶体内部均有表达。CD36属于B族清道夫受体家族的多功能蛋白，其在脊椎动物的多种细胞均有表达，如巨噬细胞、血小板、微血管内皮细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞、肠上皮细胞、肝细胞等[8]。CD36同时具有识别、转运游离脂肪酸的多种功能。Laugerette F等[9]学者利用CD36基因敲除(CD36-/-)小鼠，通过双瓶喜好实验研究发现，与野生型小鼠相比，在排除了嗅觉和触觉等影响因素后，CD36-/-小鼠对2%亚油酸的偏好显著减弱，且不能区别富含亚油酸的溶液和对照溶液，而CD36-/-小鼠对甜味的喜好和对苦味的厌恶感仍然存在，其结果说明CD36对于脂类的识别起着重要作用。临床研究[10]结果则表明，在肥胖人群中，CD36表达增加的个体与CD36表达减少的个体相比，身高体重指数较高，膳食脂肪的摄入也较多。

中枢神经系统中关于CD36的研究较少，目前的研究发现CD36在中枢神经系统中具有多种功能，有研究[11]表明，CD36可能参与中性粒细胞吞噬作用的调控，有助于减轻缺血后的炎症反应，促进组织修复，还有研究[12]发现CD36缺失可以延缓阿尔茨海默病认知功能的恶化。同时，有研究[13]表明CD36参与脂质感知，但是具体作用机制仍不明确。

本研究结果发现，活血降糖饮具有良好的减重、调脂和减轻胰岛素抵抗的作用，这与本课题组以往研究结果类似。同时本研究还发现经高脂饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗大鼠对膳食脂肪偏好明显增加，其海马组织中CD36蛋白表达也明显上调。经中药和二甲双胍干预后，这种改变被纠正。活血降糖饮下调海马组织CD36蛋白表达可能是其调控大鼠对膳食脂肪偏好的作用机制之一，但这两者之间的关联，以及胞内信号转导和蛋白表达的调控等具体作用机制，仍需进一步研究。