枸杞叶黄酮提取物对复合羊肉糜脂肪酸的影响研究

陈瑾,韩丽娜，韩梦佳，范艳丽

(宁夏大学 农学院，银川 750021)

肉类及其制品是人类饮食构成的重要组成部分，通常肉品质的营养价值用PUFA(多不饱和脂肪酸，polyunsaturated fatty acid)/SFA(饱和脂肪酸，saturated fatty acid)(P∶S)比值来衡量，美国卫生部推荐 P∶S 应高于0.45为佳。摄入过多的饱和脂肪酸可导致动脉粥样硬化[1]、血胆固醇升高等[2]。滩羊肉作为宁夏特产，脂肪分布均匀且营养丰富[3，4]，但其脂肪含量较高，P∶S比率较低[5]。将富含 n-3 多不饱和脂肪酸的植物油与滩羊肉制成混合羊肉糜能够有效地提高羊肉糜的不饱和脂肪酸含量[6，7]。但脂肪酸不饱和程度相对较高，容易氧化变质导致营养价值变低，因此脂肪酸抗氧化的研究至关重要。

黄酮类物质作为天然抗氧化剂的代表[8-10]，具有抗肿瘤、抗氧化、清除自由基等作用[11-13]，被广泛应用于食品中[14]。研究表明枸杞叶黄酮类化合物含量较高[15]，但枸杞叶多用作廉价配料，未能充分发挥其潜在价值[16,17]。本试验以枸杞叶黄酮提取物为天然抗氧化剂，通过空白对照研究在4 ℃冷藏条件下分别于试验第0，3，6，9，12，15天的脂肪酸相对含量变化，从而进一步揭示枸杞叶黄酮提取物的抗氧化活性，为枸杞叶的深加工利用及滩羊肉的保存提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

枸杞芽茶：银川育新枸杞种业有限公司；羊肉、羊脂：市售宁夏滩羊肉及其脂肪；亚麻籽油(食品级)：银川原源食品油有限公司；欧丽薇兰橄榄油(食品级)：益海嘉里食品营销有限公司；氯化钠、石油醚、苯及无水硫酸钠：均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

AL204型电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；QP2010型气相色谱-质谱联用 日本岛津公司；RE-52AA型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；JDG-0.2型真空冻干试验机 兰州科近真空冻干技术有限公司；Finnpipette 彩色数字移液器 美国热电公司(Thermo Electron)。

1.3 试验方法

1.3.1 枸杞叶黄酮化合物的制备

本试验是采用实验室自己制备的枸杞叶黄酮提取物进行的后续试验[18]。现将枸杞叶黄酮的提取过程稍做简单介绍。乙醇提取黄酮类物质的步骤如下：枸杞芽茶→粉碎→过筛→称取粉末→加入70%乙醇提取2 h，重复2次→过滤→合并滤液→浓缩→石油醚脱脂→浓缩→冷冻干燥→黄酮类化合物。

1.3.2 复合羊肉糜的构建

取羊背最长肌和羊脂肪以2∶1(m/m)混合，先后用绞肉机和斩拌机制成新鲜肉糜；以市购橄榄油和亚麻籽油按2∶3(m/m)混合均匀。以羊肉糜(83%)、混合油(10%)、食盐(2%)和饮用水(5%)搅拌混匀[19]，制成复合羊肉糜。

1.3.3 试验分组

把制成的复合羊肉糜分为2组：空白组和黄酮添加组，其中黄酮添加组在羊肉糜中添加1%枸杞叶黄酮提取物制成复合羊肉糜。所有样品装入保鲜密封袋中，做好标记，4 ℃条件下冷藏存放。分别于试验第0，3，6，9，12，15天取样测定脂肪酸相对含量。

1.3.4 脂肪酸的测定方法

1.3.4.1 脂肪提取

称取10 g混合肉糜样品，加入120 mL三氯甲烷-甲醇溶液(体积比为2∶1)，45 ℃恒温振荡2 h后过滤，向滤液中加入30 mL饱和NaCl溶液，振荡摇匀，静止分层，下层的三氯甲烷层即为脂肪提取液，用无水Na2SO4干燥后，在45 ℃水浴中用旋转蒸发器浓缩，得到脂肪。

1.3.4.2 脂肪酸甲酯化处理

采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)测定样品脂肪酸相对含量。取浓缩脂肪50 mg置于15 mL具塞试管中，加入2 mL苯-石油醚混合溶液(体积比为1∶1)，轻轻摇动使之溶解。再加入2 mL 0.4 mol/L KOH-甲醇溶液，混匀。加适量饱和NaCl溶液使全部有机相(甲醇溶液)升至试管上部。澄清后吸取上清液，装入进样小瓶中，用于GC-MS分析[20]。

1.3.4.3 气相色谱条件

色谱柱：DB-FFAP毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；压力100.1 kPa；总流量87.3 mL/min；柱流量1.04 mL/min；线速率38.9 cm/s；吹扫流量3.0 mL/min；分流比80∶1；进样量1 μL；载气为氦气；进样口温度250 ℃；升温程序：起始温度160 ℃，保持3 min，以4 ℃/min升到175 ℃，保持2 min，再以4 ℃/min升到185 ℃，保持2 min，最后以4 ℃/min升到230 ℃，保持3 min。总程序时间27.5 min[21]。

1.3.4.4 质谱条件

电子电离离子源：离子源温度250 ℃；接口温度250 ℃；溶剂延迟2 min；质量扫描范围40～450 m/z。

1.3.4.5 定性及定量分析

试验采用MST11 Library谱库相似度检索定性及峰面积定量分析，采取峰面积归一化法测定各脂肪酸的相对含量，仅报道匹配度大于70(最大匹配度为100)的结果。

1.3.5 统计分析

2 结果与分析

2.1 第0天复合羊肉糜中脂肪酸相对含量检测结果

通过GC-MS检测第0天复合羊肉糜的脂肪酸种类和相对含量，复合羊肉糜脂肪酸甲酯的GC-MS图谱见图1和图2。

图1 第0天空白组复合羊肉糜脂肪酸甲酯的GC-MS图谱Fig.1 GC-MS spectrum of fatty acid methyl ester of minced mutton for blank group at 0 day

图2 第0天黄酮添加组复合羊肉糜脂肪酸甲酯的GC-MS图谱Fig.2 GC-MS spectrum of fatty acid methyl ester of minced mutton for flavonoids added group at 0 day

脂肪酸种类脂肪酸相对含量(%,x±SD )空白组黄酮添加组SFA癸酸(C10∶D0)0.15±0.010.14±0.01月桂酸(C12∶D0)0.11±0.010.12±0.01肉豆蔻酸(C14∶D0)2.68±0.293.42±0.59十五烷酸(C15∶D0)0.35±0.070.47±0.09棕榈酸(C16∶D0)17.12±2.9818.23±0.08十七烷酸(C17∶D0)1.21±0.131.56±0.27硬脂酸(C18∶D0)19.22±1.4523.30±0.32*SFA总量40.84±3.4247.24±0.44

续 表

注：“*”表示脂肪酸相对含量较空白组具有显著差异(P<0.05)，样本量n=3。

由表1可知，第0天，黄酮添加组与空白组复合羊肉糜中饱和脂肪酸除硬脂酸外，其余相对含量均无显著差异(P>0.05)，不饱和脂肪酸相对含量无显著差异(P>0.05)。

2.2 第3天复合羊肉糜中脂肪酸相对含量检测结果

通过GC-MS检测第3天复合羊肉糜的脂肪酸种类和相对含量，复合羊肉糜脂肪酸甲酯的GC-MS图谱见图3和图4。

图3 第3天空白组复合羊肉糜脂肪酸甲酯的GC-MS图谱Fig.3 GC-MS spectrum of fatty acid methyl ester of minced mutton for blank group at 3rd day

图4 第3天黄酮添加组复合羊肉糜脂肪酸甲酯的GC-MS图谱Fig.4 GC-MS spectrum of fatty acid methyl ester of minced mutton for flavonoids added group at 3rd day

脂肪酸种类脂肪酸相对含量(%,x±SD )空白组黄酮添加组SFA癸酸(C10∶0)0.16±0.060.12±0.01月桂酸(C12∶0)0.18±0.070.13±0.01肉豆蔻酸(C14∶0)2.62±0.232.4±0.14十五烷酸(C15∶0)0.36±0.050.38±0.01棕榈酸(C16∶0)13.46±3.8418.39±1.15十七烷酸(C17∶0)1.59±0.561.16±0.08硬脂酸(C18∶0)18.26±5.0016.79±4.99SFA总量36.63±5.2039.37±3.59PUFA棕榈油酸(C16∶1)1.04±0.410.76±0.10亚油酸(C18∶2n6c)6.67±1.955.62±0.26十八烷二烯酸(C18∶2)0.30±0.060.34±0.04亚麻酸(C18∶3n3c)0.99±0.280.92±0.14花生四烯酸(C20∶4n6c)0.10±0.010.11±0.02*PUFA 总量9.11±2.637.76±0.27

注：“*”表示脂肪酸相对含量较空白组具有显著差异(P<0.05)，样本量n=3。

由表2可知，第3天，黄酮添加组与空白组复合羊肉糜中饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸相对含量均无显著性差异(P>0.05)。由此可见，复合羊肉糜在3天的冷藏过程中脂肪酸氧化进程尚未开始。

2.3 第6天复合羊肉糜中脂肪酸相对含量检测结果

通过GC-MS检测第6天复合羊肉糜的脂肪酸种类和相对含量，复合羊肉糜脂肪酸甲酯的GC-MS图谱见图5和图6。

图5 第6天空白组复合羊肉糜脂肪酸甲酯的GC-MS图谱Fig.5 GC-MS spectrum of fatty acid methyl ester of minced mutton for blank group at 6th day

图6 第6天黄酮添加组复合羊肉糜脂肪酸甲酯的GC-MS图谱Fig.6 GC-MS spectrum of fatty acid methyl ester of minced mutton for flavonoids added group at 6th day

脂肪酸种类脂肪酸相对含量(%,x±SD )空白组黄酮添加组SFA癸酸(C10∶0)0.13±0.020.11±0.01月桂酸(C12∶0)0.14±0.010.12±0.01肉豆蔻酸(C14∶0)2.62±0.292.18±0.13十五烷酸(C15∶0)0.34±0.060.27±0.02棕榈酸(C16∶0)16.95±1.7217.35±0.05十七烷酸(C17∶0)1.19±0.181.01±0.07硬脂酸(C18∶0)18.03±4.0416.14±6.02SFA总量39.40±4.4337.18±6.12PUFA棕榈油酸(C16∶1)0.79±0.111.05±0.27亚油酸(C18∶2n6c)5.51±0.265.16±0.19十八烷二烯酸(C18∶2)0.29±0.030.20±0.05亚麻酸(C18∶3n3c)0.80±0.341.18±0.42花生四烯酸(C20∶4n6c)0.05±0.010.06±0.01*PUFA总量7.44±0.227.64±0.38

注：“*”表示脂肪酸相对含量较空白组具有显著差异(P<0.05)，样本量n=3。

由表3可知，第6天黄酮添加组与空白组复合羊肉糜中饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸相对含量均无显著性差异(P>0.05)。由此可见，复合羊肉糜在6天的冷藏过程中脂肪酸氧化进程缓慢。

2.4 第9天复合羊肉糜中脂肪酸相对含量检测结果

通过GC-MS检测第9天复合羊肉糜的脂肪酸种类和相对含量，复合羊肉糜脂肪酸甲酯的GC-MS图谱见图7和图8。

图7 第9天空白组复合羊肉糜脂肪酸甲酯的GC-MS图谱Fig.7 GC-MS spectrum of fatty acid methyl ester of minced mutton for blank group at 9th day

图8 第9天黄酮添加组复合羊肉糜脂肪酸甲酯的GC-MS图谱Fig.8 GC-MS spectrum of fatty acid methyl ester of minced mutton for flavonoids added group at 9th day

脂肪酸种类脂肪酸相对含量(%,x±SD)空白组黄酮添加组SFA癸酸(C10∶0)0.16±0.030.13±0.00月桂酸(C12∶0)0.18±0.040.15±0.01肉豆蔻酸(C14∶0)3.24±1.082.85±0.04十五烷酸(C15∶0)0.35±0.030.41±0.02棕榈酸(C16∶0)17.54±0.7418.02±0.10十七烷酸(C17∶0)1.58±0.561.39±0.05硬脂酸(C18∶0)14.65±6.2023.25±0.56SFA总量37.69±5.5446.20±0.50PUFA棕榈油酸(C16∶1)1.00±0.390.89±0.07亚油酸(C18∶2n6c)7.46±2.486.21±0.18十八烷二烯酸(C18∶2)0.28±0.040.33±0.01亚麻酸(C18∶3n3c)0.80±0.081.04±0.01*花生四烯酸(C20∶4n6c)0.09±0.010.24±0.02*PUFA总量9.64±2.598.71±0.24

注：“*”表示脂肪酸相对含量较空白组具有显著差异(P<0.05)，样本量n=3。

由表4可知，第9天，黄酮添加组与空白组复合羊肉糜中饱和脂肪酸相对含量无显著性差异(P>0.05)；n-3多不饱和脂肪酸中亚麻酸含量有显著性差异(P<0.05)，黄酮添加组比空白组含量高30%；n-6多不饱和脂肪酸中花生四烯酸含量出现显著性差异(P<0.05)，黄酮添加组是空白组含量的2.67倍。

2.5 第12天复合羊肉糜中脂肪酸相对含量检测结果

通过GC-MS检测第12天复合羊肉糜的脂肪酸种类和相对含量，复合羊肉糜脂肪酸甲酯的GC-MS图谱见图9和图10。

图9 第12天空白组复合羊肉糜脂肪酸甲酯的GC-MS图谱Fig.9 GC-MS spectrum of fatty acid methyl ester of minced mutton for blank group at 12th day

图10 第12天黄酮添加组复合羊肉糜脂肪酸甲酯的GC-MS图谱Fig.10 GC-MS spectrum of fatty acid methyl ester of minced mutton for flavonoids added group at 12th day

脂肪酸种类脂肪酸相对含量(%,x±SD )空白组黄酮添加组SFA癸酸(C10∶0)0.22±0.100.12±0.01月桂酸(C12∶0)0.13±0.010.13±0.00肉豆蔻酸(C14∶0)2.17±0.422.39±0.14十五烷酸(C15∶0)0.37±0.040.32±0.02棕榈酸(C16∶0)12.90±4.1513.65±1.18十七烷酸(C17∶0)0.98±0.121.08±0.05硬脂酸(C18∶0)21.74±1.3222.55±0.59SFA总量38.51±5.6240.24±1.95

续 表

注：“*”表示脂肪酸相对含量较空白组具有显著差异(P<0.05)，样本量n=3。

由表5可知，第12天，黄酮添加组与空白组复合羊肉糜中饱和脂肪酸相对含量无显著性差异(P>0.05)；n-6多不饱和脂肪酸中花生四烯酸含量存在显著性差异(P<0.05)。

2.6 第15天复合羊肉糜中脂肪酸相对含量检测结果

通过GC-MS检测第15天复合羊肉糜的脂肪酸种类和相对含量，复合羊肉糜脂肪酸甲酯的GC-MS图谱见图11和图12。

图11 第15天空白组复合羊肉糜脂肪酸甲酯的GC-MS图谱Fig.11 GC-MS spectrum of fatty acid methyl ester of minced mutton for blank group at 15th day

图12 第15天黄酮添加组复合羊肉糜脂肪酸甲酯的GC-MS图谱Fig.12 GC-MS spectrum of fatty acid methyl ester of mincedmutton for flavonoids added group at 15th day

脂肪酸种类脂肪酸相对含量%(x±SD )空白组黄酮添加组SFA癸酸(C10∶0)0.14±0.010.17±0.03月桂酸(C12∶0)-0.19±0.03*肉豆蔻酸(C14∶0)1.67±0.312.55±0.01*十五烷酸(C15∶0)0.28±0.010.32±0.01*棕榈酸(C16∶0)14.37±3.7515.47±4.11十七烷酸(C17∶0)0.76±0.040.94±0.02硬脂酸(C18∶0)14.98±5.9611.65±1.52SFA总量32.21±3.7131.29±5.62PUFA棕榈油酸(C16∶1)0.75±0.150.62±0.08亚油酸(C18∶2n6c)4.31±0.034.58±0.07*十八烷二烯酸(C18∶2)0.25±0.010.25±0.01亚麻酸(C18∶3n3c)0.86±0.080.79±0.00花生四烯酸(C20∶4n6c)-0.04±0.02*PUFA总量6.17±0.156.28±0.11

注：“*”表示脂肪酸相对含量较空白组具有显著差异(P<0.05)，样本量n=3。

脂肪酸氧化分为自动氧化与酶促氧化。饱和脂肪酸经酶促氧化，产生的最终产物为酮酸和甲基酮；不饱和脂肪酸经光照产生自由基，再与氧气反应生成过氧化自由基，最终为氢过氧化物，过氧化自由基与不饱和脂肪酸反应生成的自由基与氧气反应生成过氧化自由基。由表6可知，第15天时黄酮添加组与空白组复合羊肉糜饱和脂肪酸中月桂酸、肉豆蔻酸、十五烷酸相对含量有显著性差异(P<0.05)；含量分别比空白组高出19%，52.69%，14.28%；n-6多不饱和脂肪酸中花生四烯酸与亚油酸含量存在显著性差异(P<0.05)，含量分别比空白组高出6.3%，4%。由此可见，复合羊肉糜在15天的冷藏过程中脂肪酸含量存在较大变化。

综上结果显示：复合羊肉糜加入黄酮第9天后亚麻酸含量有显著性差异(P<0.05)，可知黄酮的添加对n-3多不饱和脂肪酸中亚麻酸有抗氧化效果；第9，12，15天花生四烯酸含量均有显著性差异(P<0.05)，表明黄酮对于n-6多不饱和脂肪酸中花生四烯酸的抗氧化效果明显；饱和脂肪酸中月桂酸、十五烷酸、肉豆蔻酸含量于第15天出现显著性差异(P<0.05)，表明黄酮的添加对其有抗氧化效果。

2.7 冷藏过程中复合羊肉糜脂肪酸相对含量的变化分析

从上述分析可以看出，随冷藏时间延长，复合羊肉糜中饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸总量在冷藏过程中均呈先上升后下降的趋势，与牛珺等人的研究结果一致[22,23]。饱和脂肪酸中主要以硬脂酸含量最多，其总含量占总脂肪酸含量的42.40%左右。多不饱和脂肪酸中，亚油酸含量在冷藏过程中均很高。且添加枸杞叶黄酮提取物的羊肉糜体系中饱和脂肪酸中的硬脂酸在第12天含量达到最高，于第15天含量开始下降；棕榈酸在第3天含量达到最大后开始下降；n-3多不饱和脂肪酸中亚麻酸在第6天含量达到最高后呈下降趋势；n-6多不饱和脂肪酸中花生四烯酸在第9天含量最高；而亚油酸呈直接下降趋势。空白组中饱和脂肪酸中的肉豆蔻酸、棕榈酸在第9天含量最高，后开始呈下降趋势，十五烷酸、硬脂酸于第12天含量达到最高后开始下降。且黄酮添加组中饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸最大含量均大于空白组。

3 结论

本文将枸杞叶黄酮提取物添加到由植物油和羊肉构建的复合羊肉糜中，通过检测冷藏期内体系的脂肪酸相对含量的变化，研究枸杞叶黄酮提取物作为天然抗氧化剂对复合羊肉糜脂肪酸的影响。试验结果表明，枸杞叶黄酮提取物对于复合羊肉糜在贮藏过程中饱和脂肪酸中的月桂酸、十五烷酸、肉豆蔻酸有抗氧化效果；n-3不饱和脂肪酸中的亚麻酸有显著的抗氧化效果；n-6多不饱和脂肪酸中的花生四烯酸抗氧化效果显著；且在冷藏过程中黄酮添加组脂肪酸最大含量均高于空白组；各脂肪酸含量均呈现先上升后下降的趋势。综上所述，枸杞叶黄酮提取物具有显著的脂肪酸抗氧化效果，是一种效果良好的天然抗氧化剂，具有开发利用价值。