高效液相色谱法同时测定食醋和酱油中的6种防腐剂和甜味剂

张小芳，付大友

(四川理工学院，四川 自贡 643000)

近年来，随着消费者对食品安全问题的日益关注，食品中的各种添加剂受到人们越来越多的重视。人工合成的甜味剂和防腐剂作为食品添加剂被广泛地应用在各类食品中，但过量使用会对人体造成危害，因此，对它们的使用必须进行严格的监控[1，2]。目前，我国对食品中防腐剂和甜味剂的使用限量做了明确的规定，建立食品中防腐剂和甜味剂的含量准确测定方法是十分重要的。

食醋和酱油是我国常用的调味品，山梨酸、脱氧乙酸、苯甲酸以及对羟基苯甲酸乙酯是酱油和食醋中最常见添加的防腐剂，为改善口感，向食醋和酱油中加入少量的甜味剂如糖精钠、安赛蜜等用于调味。为保证消费者的健康，建立一种快速、简便的检测酱油和食醋中防腐剂和甜味剂的方法十分必要。目前对酱油和食醋中防腐剂和甜味剂的检测在国标的标准方法中均有明确的使用要求，主要有气相色谱法、高效液相色谱法、离子色谱法等[3-18]。但绝大部分方法都只能同时检测几种添加剂，且前处理和液相分离条件复杂。本文建立一种高效液相色谱法梯度洗脱同时测定酱油和食醋中山梨酸、脱氢乙酸、苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯、糖精钠、安赛蜜的方法，该方法前处理简单、灵敏度高、精密度、准确度好，有利于提高实验室的检测效率。

1 材料与方法

1.1 实验仪器与试剂

1.1.1 仪器

安捷伦1100 Series型液相色谱仪(紫外可见光检测器)； AR1140分析天平 梅特勒-托利多仪器有限公司；KQ3200超声波清洗仪 昆山市超声仪器有限公司；H1650R离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司。

1.1.2 试剂

苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜(1 mg/mL，国家标准物质中心)；脱氢乙酸、对羟基苯甲酸乙酯 (99%，天津博迪化工有限公司)；乙酸铵、亚铁氰化钾、盐酸、乙酸锌(分析纯)；甲醇(色谱纯)；实验室用水，均为二级蒸馏水；微孔滤膜0.22 μm;食醋和酱油，市售。

1.2 色谱条件

Welch Xtimate C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，粒径为5 μm)，柱温为35 ℃，流速为1.0 mL/min，检测波长为230 nm；流动相为甲醇(A)∶0.02 mol/L的乙酸铵溶液(B)。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱条件

1.3 标准溶液的配制

准确称量脱氢乙酸、对羟基苯甲酸乙酯各0.1000 g于100 mL的容量瓶中用甲醇定容，每种标准储备溶液浓度为1.000 mg/mL。然后分别取各种标准储备液0.5，1.0，2.0，4.0，5.0 mL于50 mL的容量瓶中，分别加入20 mL甲醇，用水定容至刻度，其浓度分别为10，20，40，80，100 μg/mL的标准混合溶液，通过0.22 μm的滤膜过滤后上机检测，以峰面积对样品浓度进行线性回归。

1.4 样品前处理

准确称取样品5 g于25 mL的容量瓶中，依次加入0.8 mL 10%的亚铁氰化钾，加入0.8 mL 20%的乙酸锌溶液，加入10 mL甲醇，最后用水定容至刻度，于离心机上转速4000 r/min离心5 min,取清液过滤待测。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

用TU-1901型双光束紫外可见分光光度计在190～400 nm 波长下对标准溶液进行扫描。6种化学成分的最大吸收波长在210～250 nm之间，糖精钠、安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、对羟基苯甲酸乙酯的最大吸收波长依次为：210，215，220，230，225，245 nm，为尽可能兼顾所有目标化合物的灵敏度，本实验选用230 nm为检测波长。紫外-可见光谱图见图1。

图1 紫外-可见光谱图

2.2 流动相及流动相pH的选择

实验分别采用甲醇+甲酸铵缓冲溶液、甲醇+磷酸二氢铵、乙腈+甲酸铵缓冲溶液、甲醇+乙酸铵缓冲液、乙腈+乙酸铵缓冲溶液，结果显示：以甲醇+乙酸铵缓冲液为流动相时，6种物质分离效果最佳，灵敏度高，本实验采用乙酸来调节pH值，分别对pH 3.5，4.0，4.5，5.5，6.0进行实验，结果显示：当pH<4.5时，峰型有拖尾，其中1种物质不能出峰，pH较高时出峰时间延时,有2种物质不能完全分离(见图2)，因此本实验选择流动相的酸度调节到4.5。

图2 pH对被测物分离的影响

2.3 样品提取溶剂的选择

称取一定量的样品分别考察了甲醇、乙醇、乙腈、水的提取效果，结果显示：当用水为提取液时，样品与水互溶，上机检测的色谱图杂峰最多，分离困难；提取液为甲醇、乙醇、乙腈时，甲醇的分离效果最佳，静置分层后清澈，上机检测的色谱图杂质峰最少，无拖尾，分离度最高，因此选甲醇提取液较为理想。同时考察甲醇提取液的比例，用20%，40%，60%的甲醇溶液为提取液分别提取一定量的样品，当提取液为60%的甲醇溶液时，糖精钠和安赛蜜峰型均有拖尾；用20%的甲醇溶液提取时，对羟基苯甲酸乙酯响应值特别低，综合考虑，本实验采用40%的甲醇溶液为提取溶剂。

2.4 流动相流速的选择

流动相的流速主要对溶质与固定相和流动相的相互作用有影响，从而改变待测组分的保留时间。流速太快，可能导致柱压过高，引起漏液；流速太慢，会增加待测物的保留时间，容易引起色谱峰拖尾现象。所以实验过程中要选择合适的流速，保持其他条件不变，改变流动相的流速为0.5，0.6，0.8，1.0，1.2 mL/min进行实验。实验结果表明：流速低于0.6 mL/min时出峰时间延迟，有拖尾现象；流速超过1.2 mL/min时柱压过高，出峰太快，分离效果不佳。综合考虑样品的分离度和分析时间，最终选定流速为1.0 mL/min,6种物质能完全分离。

2.5 线性范围与检出限

在确定的实验条件下，以峰面积Y为纵坐标，质量浓度C(μg/mL)为横坐标绘制标准曲线，得出线性方程，见图3。按信噪比(S/N)=3计算最低检出限(LOD)，为0.15～0.23 mg/L，见表2。

图3 6种被测物的标准工作曲线

化合物线性回归方程相关系数R2检出限(mg/L)苯甲酸 y=16.202x+1.92060.99960.15安赛蜜 y=24.001x+3.83610.99980.17山梨酸y=18.728x-2.41240.99970.18脱氢乙酸 y=8.4849x+2.92890.99970.22对羟基苯甲酸乙酯y=11.82x+4.97530.99940.23糖精钠 y=3.5805x+0.56190.99980.20

由图3和表2可知，该方法对6种待测化合物具有较宽的线性范围且具有良好的相关性，相关系数≥0.9994。

2.6 样品检测结果

按照上述样品的制备方法分别处理酱油和食醋样品，根据液相色谱分析条件检测各个样品溶液，测得峰面积，带入回归方程，计算得到样品含量结果，见表3。结果表明：5种酱油中均检测出添加防腐剂，2种添加甜味剂，5种食醋中检测出3种添加防腐剂，图4中a，b，c 分别为6种被检测物质、1种酱油和食醋的色谱图。

表3 样品检测结果 g/L

注：ND为未检出。

图4 标准品及样品色谱图

2.7 加标回收率与精密度

本实验采用空白样品中添加标准溶液的方法，对食醋样品进行加标回收实验，分别添加3个质量浓度水平的标样溶液：10，40，80 μg/mL，按照以上设定的实验方法，分别测定其含量，不同浓度水平样品进行6次重复实验，计算出加标回收率和精密度。

表4 6种被检测物质加标回收率和精密度

由表4可知，目标化合物的平均回收率为97.24%～103.50%，RSD为1.45%～2.89%，结果表明：该方法的精密度和回收率都符合国内外的相关标准，该方法的准确度和精密度良好。

3 结论

本文建立了采用高效液相色谱同时检测酱油和食醋中6种添加剂的方法，各个待测组分均具有良好的分离度、精密度和准确度，该方法操作简单、快速且成本较低，符合相应的检测需求，适用于实验室中大批量样品的检测。