小枣黑疔病拮抗放线菌的筛选与发酵优化

洪 亮, 杨丽芬, 杨 建 *, 郭建伟, 程加省

(1. 红河学院云南省农作物优质高效栽培与安全控制重点实验室，云南 蒙自 661100; 2. 云南省农业科学院粮食作物研究所，云南 昆明 650205)

【研究意义】枣树因耐贫瘠、耐旱、耐盐碱，成为山、沙、碱、旱地区重要的生态经济林树种，中国山东、河北、山西、河南、新疆等省种植面积达133.3 万hm2左右，干枣成为中国第一大干果。蒙自小枣为云南蒙自一种古老的地方性枣树 (ZiziphusjujubaMill)品种，适宜于微碱性的轻壤土[1]。据报道，截止2004年云南红河州蒙自县、建水县等地区已种植蒙自小枣、金丝小枣等1000万hm2，爆发有枣锈病、枣疯病、黑斑病、缩果病、裂果病、烂果病等，其中枣缩果病、黑斑病或黑疔病(烂果病一种)的病原菌为细极链格孢(Alternariatenuissima)或细交链格孢(Alternariaalternata)[2-6]，普遍发生于新疆、山西、河北、山东、云南、天津等中国枣主产区，重则发病率达30 %。枣黑疔病的防治对中国枣产业的可持续发展具有重要的意义。【前人研究进展】放线菌是一类能产生2/3以上的临床应用及农用生物活性代谢产物(如酶、抗生素等)的重要微生物[7]，因而筛选动、植物病害拮抗放线菌成为发现生防菌株的有效途径。目前，已有防治腐霉菌(Pythiumspp)、镰刀菌(Fusariumspp)、疫霉菌(Phytophthoraspp)和丝核菌(Rhizoctoniaspp)等多种植物病原菌的市场化放线菌活菌剂及抗生素制剂[8]。【本研究切入点】以红河州蒙自小枣黑疔病链格孢菌(Alternariasp.)为靶标，以大庆油田土壤12株及臭灵丹17株、肾茶26株内生放线菌为供试菌株，采用滤纸片法筛选高拮抗菌株，继而进行碳氮源、碳氮比、温度、时间等发酵条件的优化，并初步探索活性物质的极性。【拟解决的关键问题】研究结果将获得枣黑疔病高拮抗放线菌，优化发酵条件并探明活性物质的极性，为生防菌剂开发及抗菌活性物质的分离奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

病原菌：链格孢菌(Alternariasp.)，分离自患有黑疔型烂果病的蒙自小枣。

供试放线菌：大庆油田土壤放线菌12株、臭灵丹内生放线菌17株、肾茶内生放线菌26株，总计55株。

培养基：PDA培养基、张攀等培养JY-22的最佳培养基(SIM)[9]。

1.2 试验方法

1.2.1 供试拮抗菌株的筛选 以PDA液体培养基接种链格孢菌，180 r/min、28 ℃培养2 d，过滤并调整孢子浓度为1×106 cfu/mL，备用；以SIM液体培养基接种放线菌，180 r/min、28 ℃培养7 d，过滤并取滤液12 000 r/min离心15 min，取上清液备用。取150 μl链格孢菌菌悬液涂布在PDA培养基上，然后在每个平板上放置直径0.6 cm的无菌圆滤纸片，每片滤纸片上滴加30 μl放线菌离心上清液，以SIM液体培养基作为对照，28 ℃对峙培养7～15 d，每个菌株3个重复，于第7～15天测量抑菌带宽度。以拮抗活性最高的菌株作为发酵条件优化供试菌株。

1.2.2 碳氮源优化 碳源优化：分别以等质量的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、玉米粉作为碳源替代基础培养基中的可溶性淀粉。

氮源优化：分别以等质量的硫酸铵、硝酸铵、酵母粉、黄豆粉、蛋白胨、硝酸钾、干酪素等作为氮源替代SIM中的黄豆粉、酵母粉或蛋白胨。

碳氮比优化(C/N比)：以筛选的最佳碳源、氮源替代SIM中相应碳源、氮源，设置2/18、2/20、2/22、2/24、2/26等5个梯度(本文章中C/N比仅代表供试替换碳源与氮源的质量比，即N质量不包括SIM中另2种氮源)。

上述研究均采用28 ℃、180 r/min恒温摇床振荡培养，每个处理3个重复，取培养7 d的发酵液离心液(去除菌体)测试抑菌圈直径。

1.2.3 发酵温度优化 以上述研究的最佳培养基接种供试放线菌，设置22、24、26、28、30 ℃等5个温度梯度，180 r/min恒温摇床振荡培养，每个处理3个重复，培养7 d测试抑菌圈直径。

1.2.4 发酵时间优化 以最佳培养基接种供试放线菌，最佳发酵温度培养，在第3～11天逐日取样测试发酵液抑菌圈直径。

1.2.5 活性物质极性测试 取发酵时间优化试验中第6天的发酵液300 mL，高速离心去除菌体经真空旋转蒸发仪浓缩，然后以等量80 %乙醇40 ℃浸泡48 h，然后依次用氯仿、乙酸乙酯萃取，静置过夜，乙酸乙酯相、氯仿相、乙醇相均需经真空旋转蒸发仪去除溶剂，再取干物质的1/20分别以15 mL氯仿、乙酸乙酯、无菌水溶解，最后分别取30 μl氯仿相、乙酸乙酯相、乙醇相、离心发酵液滴加在无菌滤纸片上，待有机溶剂挥发后，取滤纸片测试抑菌活性。

2 结果与分析

2.1 拮抗放线菌的筛选

从55株放线菌中筛选到2株链格孢拮抗菌，分离自肾茶根部的内生放线菌BEG-46第7、15天的抑菌直径分别为13.6、8.1 mm；分离自臭灵丹茎部的内生放线菌BAJ01第7、15天的抑菌直径分别为6.1、3.2 mm，因而以BEG-46作为供试菌株优化发酵条件。

2.2 碳氮源优化

如图2所示，最佳碳源为抑菌圈直径达13.0 mm的葡萄糖，其次是作为对照SIM中的可溶性淀粉(抑菌圈直径10.4 mm)；如图3所示，以酵母粉替代黄豆粉、蛋白胨的抑菌圈直径分别达16.1 mm、13.7 mm，最佳氮源为酵母粉；如图4所示，最佳C/N比为2∶20，抑菌圈直径达22.2 mm。因而优化后的SIM培养基成分为：葡萄糖2 g，酵母粉20 g，蛋白胨2 g，NaCl 4 g，CaCO34 g。

图1 BEG-46发酵液对链格孢菌的拮抗作用Fig.1 The antagonism of strain BEG-46’s fermentation broth on Alternaria sp.

图2 碳源对BEG-46菌株抑菌活性的影响 Fig.2 Antaganistic effect of carbon sources on BEG-46

1.基础培养基中氮源，2.硫酸铵替换黄豆粉，3.硫酸铵替换酵母粉，4.硫酸铵替换蛋白胨，5.硝酸铵替换黄豆粉，6.硝酸铵替换酵母粉，7.硝酸铵替换蛋白胨，8.酵母粉替换黄豆粉，9.酵母粉替换蛋白胨，10.黄豆粉替换酵母粉，11.黄豆粉替换蛋白胨，12.蛋白胨替换黄豆粉，13.蛋白胨替换酵母粉，14.硝酸钾替换黄豆粉，15.硝酸钾替换酵母粉，16.硝酸钾替换蛋白胨，17.干酪素替换黄豆粉，18.干酪素替换酵母粉，19.干酪素替换蛋白胨图3 氮源对BEG-46菌株抑菌活性的影响Fig.3 Antaganistic effect of nitrogen sources on BEG-46

图4 碳氮比对BEG-46菌株抑菌活性的影响Fig.4 Antaganistic effect of C/N ratio on BEG-46

2.3 发酵温度优化

如图5所示，BEG-46菌株在28 ℃以前随温度的增加抑菌性增强，在30 ℃时发酵液抑菌活性急剧下降。因此，28 ℃为最佳发酵温度。

图5 培养温度对BEG-46菌株抑菌活性的影响Fig.5 Antaganistic effect of temprature on BEG-46

图6 发酵时间对BEG-46菌株抑菌活性的影响Fig.6 Antaganistic effect of fermentation time on BEG-46

2.4 发酵时间优化

如图6所示，发酵第7天之前抑菌圈直径随发酵时间的增加而增加，第7天的时达到最大值22.7 mm，而后随发酵时间的增加而减小。因此，第7天为最佳发酵时间。

2.5 活性物质极性测试

如表1所示，抑菌活性物质存在于乙醇相，表明抑菌活性物质极性较大。

3 讨 论

研究表明，微生物次生代谢产物的合成与培养基成分、温度、发酵时间等培养条件密切相关，其次生代谢产物浓度在不同的培养条件下相差达400倍[10]；在培养基中添加不同的金属离子可以影响其次生代谢产物的多样性及量的积累[11]。本研究从55株放线菌筛选2株链格孢拮抗菌株，其中BEG-46拮抗活性较高，其最佳发酵条件：优化SIM培养基成分为葡萄糖2 g，酵母粉20 g，蛋白胨2 g，NaCl 4 g，CaCO34 g，发酵温度28℃，发酵时间为7 d，相对原培养条件抑菌活性提高了118.3 %。结果表明，碳源为葡萄糖时抑菌活性较强，优化后的培养基成分及培养条件显著提高了BEG-46的抑菌活性。这与张攀等[9]、Monaghan等[10]研究结果一致，但相对张攀等[9]氮源成分减少为酵母粉、蛋白胨，减少了工业化生产的操作环节从而节省时间提高生产效率，对利用微生物菌剂防治云南小枣黑疔病病菌链格孢具有重要的潜在应用价值。但尚有不足之处，如赵莹等[12]以当地廉价易得的大豆粉作为优化培养基的氮源，本研究采用的酵母粉、蛋白胨在工业化生产中加工成本高，或许以云南本地廉价易得的玉米粉、蚕豆粉等作为替代氮源，实际应用的意义更大；此外，赵莹等[12]还研究了优化培养基对拮抗菌株生物量的影响，王再强等[13]探讨了云南廉价的玉米淀粉等7种碳源及4种氮源对拮抗菌株生物量和抑菌活性的影响，张正芸等[11]探讨了金属离子对活性菌株次生代谢产物量积累的影响，柳成宾等[14]以响应面法探索了转速、初始pH值、接种量、装液量等对拮抗菌株抑菌活性的影响。因而，瞄准更为廉价的氮源、金属离子、转速、初始pH值、接种量、装液量等对拮抗菌株BEG-46生物量及抑菌活性的影响问题开展后续研究，开发成本低、抑菌活性强的生防菌剂创造条件。本研究发现抑菌活性物质的极性较大，易溶于水，这与邵光灿等[15]的研究结果一致，为该生防菌次生代谢物的分离提供了依据。BEG-46对小枣黑疔病链格孢具有高拮抗活性，并且其抑菌活性物质极性高、易溶于水，具有防治红河州小枣黑疔病链格孢的应用潜力。

表1 抑菌活性物质的极性分析

4 结 论

通过滤纸片法从55株放线菌中筛选到2株链格孢拮抗菌，其中分离自肾茶根部的内生放线菌BEG-46第7天的抑菌直径达13.6 mm；经单因素实验设计优化后的发酵条件为葡萄糖2 g，酵母粉20 g，蛋白胨2 g，NaCl 4 g，CaCO34 g，发酵温度28 ℃，发酵时间为7 d；优化条件下的BEG-46发酵液抑菌活性相对原培养条件提高了118.3 %；其活性物质极性高、易溶于水。