梨黑斑链格孢菌次生代谢产物的分离鉴定及毒素含量分析

卢春珍 万传星*

（1新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室，新疆 阿拉尔 843300）

（2塔里木大学生命科学学院，新疆 阿拉尔 843300）

链格孢属是以细链格孢菌（A.tenuissima）为模式种建立起来的半知菌亚门链格孢属（Alternaria）真菌［1］。截止目前，全世界已经发表的链格孢菌属真菌约736个种，且有新种在不断发表。绝大数的链格孢菌具有病原和腐生的特质，普遍存在于环境中，主要寄生于瓜果、蔬菜、粮食及饲料作物等，是引起农产品腐烂变质的主要病原真菌。链格孢菌能够引起多种植物病害，如苹果链格孢菌引起苹果的轮斑病、番茄链格孢菌引起番茄的茎枯病、菊池链格孢菌引起梨的黑斑病、芸薹链格孢引起白菜的黑斑病以及梨黑斑链格孢菌引起梨的黑斑病等［2］，严重影响作物、瓜果、蔬菜的产量和经济收入。

链格孢菌可产生生物毒素类化合物，目前检测出的链格孢菌毒素达70余种［3］。链格孢菌毒素按寄主专化性可分为两类，即选择性毒素和非选择性毒素。按化学结构分为四种类型：（1）二苯并吡喃酮类衍生物，代表性毒素有交链格孢酚、交链格孢酚单甲醚、交链孢烯；（2）四氨基酸衍生物类，代表毒素有细交链孢菌酮酸；（3）少量的链格孢霉代谢物苝醌类，代表毒素有交链孢毒素；（4）一系列长链氨基多元醇的丙三羧酸酯类化合物。研究较多的毒素为交链格孢酚、交链格孢酚甲基醚和腾毒素等［4-8］。这些毒素具有致病、致畸、致突变的特性［9-11］，对人、畜健康造成隐患。

新疆是我国红枣、苹果、香梨、葡萄等果品的重要产区，链格孢菌不但广泛引起诸如红枣黑头病、苹果和梨黑斑病等大田危害，而且链格孢菌所产毒素具有“致癌、致畸和致突变”等慢性毒性，对新疆果品的品质和食用安全提出严重挑战，近几年，欧美和韩日诸国突然加速了对链格孢菌毒素检测分析的研究，欧盟还拟将该类毒素的检测纳入限量标准，然而我国对此类毒素结构的分离鉴定和检测分析尚不系统，亟待加强。为此，本研究对一株源于库尔勒香梨的梨黑斑链格孢菌（Alternaria gaisen）进行了次生代谢产物的分离鉴定，并比较分析梨链格孢菌利用库尔勒香梨、苹果、西红柿、马铃薯、大米、燕麦等不同营养基质后的产毒含量，以期对新疆乃至全国果品链格孢菌毒素的监测提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

主要仪器：LC-20AT型高效液相色谱仪（日本岛津公司，含LC-20AT二元高压梯度泵，SPD-M20A紫外检测器，Labsolutions色谱工作站）；Agilent HPLC色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，美国Agilent公司）；Waters制备液相色谱仪（美国Water公司，Waters 2489紫外检测器，Waters 2545二元高压梯度泵）。D101大孔树脂（天津浩聚公司）；SpehadexLH-20（Pharmacia公司）：核磁共振仪500 MHz（瑞士BRUKER公司）；色谱级甲醇（北京百灵威有限公司）。

1.2 提取与分离

1.2.1 供试菌株

分离自库尔勒香梨的一株梨黑斑链格孢菌（Alternaria gaisen），由塔里木大学生命科学学院张锐利老师惠赠。

1.2.2 培养基

产孢培养基（PDA）：马铃薯200 g，琼脂16 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 L。

种子培养基（PDB）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 L。

发酵培养基：①马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 L；②库尔勒梨200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 L；③西红柿200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 L；④大米200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 L；⑤燕麦200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 L；⑥苹果200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 L。

1.2.3 发酵液的制备

1.2.2 提出护理问题 胸椎骨折手术风险大,术后并发症多,会不同程度降低患者生活质量。循证护理小组通过与患者及家属深入交流,了解患者需求,结合护理经验和患者病情,提出亟需解决的术后护理问题,主要包括:胸椎骨折术后容易发生哪些并发症?如何有效预防和减少术后并发症的发生,改善患者预后?

活化梨黑斑链格孢菌，接种于PDA琼脂培养基上，28℃培养7 d。采用PDB种子液培养基，用无菌打孔器在培养基中打孔，挑取四块菌饼接种于种子液培养基中，28℃、180 rpm摇床培养3 d即为种子液。发酵培养液为上述培养基，其中以库尔勒香梨为主要营养基质的培养液发酵15 L，其余五种营养基质的培养液分别发酵3 L，采用500 mL三角瓶，装液量为150 mL，每瓶接种4个菌饼，28℃、180 rpm摇床培养7 d。

1.2.4 次生代谢产物的分离鉴定

将15 L梨黑斑链格孢菌发酵液经4层纱布过滤，使菌丝体与滤液分离，滤液通过D101大孔树脂柱进行吸附，蒸馏水洗脱后，依次用30%，50%，70%，100%的甲醇进行洗脱，收集50%、70%、100%三个浓度梯度甲醇洗脱液，浓缩后得到浸膏A 203 g，菌丝体用甲醇热回流提取3次，每次不低于0.5 h，将3次得到的提取液合并浓缩，得到浸膏B 134 g，通过HPLC分析后A、B无明显差异将其合并，得总浸膏237 g。采用硅胶柱层析、制备高效液相色谱等方法，分离链格孢菌次生代谢产物，并通过1D&2D NMR技术鉴定梨链格孢菌次生代谢产物的化学结构。

1.2.5 不同营养条件毒素含量分析方法

将分离自梨黑斑链格孢菌的4个毒素类化合物配置成1.0 mg/mL母液，倍性稀释为1.0、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 mg/mL等系列浓度作标准品溶液。HPLC分析条件为：检测波长254 nm，进样量8 μL，流动相60%甲醇-水，时间35 min，通过面积归一法测得标准曲线如表1所示。

将上述4个毒素类化合物进行混合标品HPLC分析（如图1所示），可基于标准曲线检测不同营养基质条件下发酵物中毒素含量。

图1 4种链格孢菌毒素成分HPLC分析色谱图

2 结果与分析

2.1 梨链格孢菌次生代谢产物的结构鉴定

化合物1：浅褐色粉末，分子式C15H16O6。1H-NMR（ 500 MHz,DMSO-d6）δ:6.51（1H,d,J=2.0 Hz,H-4）,6.76（1H,d,J=2.0 Hz,H-6）,2.27（1H,dd,J=13.0 Hz,J=3.0 Hz,H-3′）,1.96（1H,dd,J=13.0 Hz,J=7.5 Hz,H-3′）,3.70（1H,m,H-4′）,3.95（1H,m,H-5′）,6.32 （1H,d,J=2.0 Hz,H-6）,3.86（3H,s,H-5-OCH3）,1.47（3H,s,H-2′-CH3）,5.31（1H,d,J=6.5 Hz,H-5′-OH）,5.14（1H,d,J=6.5 Hz,H-4′-OH）;13C-NMR（125 MHz,DMSO-d6）δ:139.7（C-1）,100.5（C-2）,163.5（C-3）,101.4（C-4）,166.3（C-5）,102.9（C-6）,168.7（C-7）,132.3（C-1′）,81.2（C-2′）,39.0（C-3′）,69.3（C-4′）,69.9（C-5′）,131.5（C-6′）,56.3（5-OCH3）,27.9（2′-CH3）。以上数据与文献报道数据基本一致［12-13］，故确定化合物1为交链孢烯（Alternuene）。

化合物3：为褐色无定型粉末，分子式为C14H10O6。1H-NMR（500 MHz,DMSO-d6）δ:6.53（1H,d,J=1.5 Hz,H-4）,7.01（1H,d,J=1.5 Hz,H-6）,6.79（1H,s,H-3′）,7.52（1H,d,J=1.5 Hz,H-6′）;13C-NMR（125 MHz,DMSO-d6）δ:137.9（C-1）,98.9（C-2）,164.1（C-3）,100.4（C-4）,167.1（C-5）,98.3（C-6）,165.4（C-7）,109.4（C-1′）,144.6（C-2′）,103.8（C-3′）,149.6（C-4 ）,144.1（C-5′）,109.4（C-6′）,56.4（5-C-OCH3）。以上数据与文献报道数据基本一致［18-20］，故确定化合物3为链格苝醇（Alternuisol）。

化合物4：黄色粉末，分子式C15H12O5。1HNMR（500 MHz,DMSO-d）δ:6.44（ 1H,d,J=2.0 Hz,H-4）,7.17（1H,d,J=2.0 Hz,H-6）,6.57（1H,d,J=2.0 Hz,H-3′）,6.68（1H,d,J=2.0 Hz,H-5′）,3.85（3H,s,H-OCH3）,2.68（3H,s,H-CH3）,11.85（H-3-OH）,9.12（H-4′-OH）;13C-NMR（125 MHz,DMSO-d6）δ:138.2（C-1）,98.9（C-2）,165.2（C-3）,99.0（C-4）,165.0（C-5）,103.6（C-6）,166.6（C-7）,109.7（C-1′）,153.2（C-2′）,101.8（C-3）,158.5（C-4′）,117.5（C-5′）,138.7（C-6′）,55.3（5-C-OCH3）,24.7（C-CH3）。以上数据与文献报道数据基本一致［21-22］，故确定化合物4为交链格孢酚单甲醚（Aternariol methyl ether）。

化合物5：白色粉末，分子式：C8H8O3。1H-NMR（500 MHz,DMSO-d6）δ:6.01（1H,s,H-2）,3.89（1H,dd,J=2.6 Hz,J=7.0 Hz,H-5）,4.50（1H,dd,J=2.6 Hz,J=7.0Hz,H-5）,6.72（1H,dd,J=7.2 Hz,J=15.0 Hz,H-6）,6.37（1H,dd,J=2.0 Hz,J=15.0 Hz）,1.89（3H,dd,J=1.5 Hz,J=7.0 Hz,H-8）,5.79（H-4-OH）,5.67（H-5-OH）;13C-NMR（125 MHz,DMSO-d6）δ:204.1（C-1,125.2 C-2）,168.9（C-3）,81.1（C-4）,76.8（C-5）,139.7（C-6）,125.9（C-7）,19.6（C-8）。以上数据与文献报道数据基本一致［23-24］，故确定化合物5为土曲霉酮（Terrein）。

化合物6：淡黄色粉末，分子式：C9H11O3N。HNMR（500 MHz,DMSO-d6）δ:6.09（1H,d,J=2.0 Hz,H-2）,6.03（1H,d,J=2.0 Hz,H-4）,6.03（1H,d,J=2.0 Hz）,3.50（1H,s,H-7）,2.07（3H,s,H-9）;13C-NMR（125 MHz,DMSO-d6）δ:158.8（C-1）,101.4（C-2）,158.8（C-3）,107.9（C-4）,136.9（C-5）,107.9（C-6）,50.6（C-7）,206.6（C-8）,29.6（C-9）。根据以上数据，结合HSQC、HMBC谱，将NMR数据进行归属，鉴定化合物6为7-氨基-1,3-二羟基-苯丙酮（7-amino-1,3-dihydroxy-propiophen）［25］。

2.2 不同营养条件下毒素成分含量分析

4种链格孢菌毒素标准曲线回归方程及相关系数，如表1所示：

表1 4种链格孢菌毒素标准曲线回归方程及相关系数

图2 梨黑斑链格孢菌利用不同营养基质所产毒素成分含量的比较

梨黑斑链格孢菌利用不同营养基质产度含量分析结果如图2所示，梨链格孢菌利用不同营养物质，所产主要生物毒种类相同，但毒素的含量存在明显差异。梨链格孢菌以库尔勒香梨、马铃薯、西红柿为营养时的毒素含量明显高于以大米、燕麦、苹果为营养时的毒素含量。对于交链格孢酚，以西红柿作为培养基时含量最高，为102.5 μg/mL；以库尔勒香梨为培养基时含量次之，为83.2 μg/mL；以苹果为培养基时含量最少，为23.2 μg/mL。对于交链格孢酚单甲醚，以库尔勒香梨作为培养基时含量最高，为92.1 μg/mL；以西红柿为培养基时含量次之，为87.9 μg/mL；以大米为培养基时含量最少，为27.4 μg/mL。对于链格苝醇，以西红柿作为培养基时含量最高，为77.3 μg/mL；以库尔勒香梨为培养基时含量次之，为67.7 μg/mL；以燕麦为培养基时含量最少，为34.5 μg/mL。对于交链孢烯，以马铃薯作为培养基时含量最高，为105.5 μg/mL；以库尔勒香梨为培养基时含量次之，为64.5 μg/mL；以大米为培养基时含量最少，为18.4 μg/mL。

3 小结与讨论

由链格孢菌引起的梨果实上的黑斑病是重要的储藏期病害，在果实表面形成圆形或不规则黑褐色病斑，中间凹陷，潮湿时病斑表面生黑色霉层，影响水果的质量和商品价值。2004年我国鸭梨曾因黑斑病而被停止出口美国和加拿大。多年来链格孢菌造成梨果病害更是有增不减，对新疆果农的收入造成严重的经济损失。

目前，世界上已报道的从梨果实上分离到的链格孢菌已命名的有9个种，中国报道的有5个种，分别是梨黑斑链格孢菌（A.gaisen）、链格孢菌（A.alternata）、细极链格孢（A.tenuissim）、鸭梨侵染链格孢（A.yaliinficiens）和侵染链格孢菌（A.infactoria）。其中，梨黑斑链格孢菌既能侵染梨叶片也能侵染果实，并产生寄主专化性毒素-AK毒素，是真正的梨黑斑病原菌［26］，梨黑斑链格孢菌和细极链格孢菌营养专化性不强，多生于植物的枯死部分或衰弱组织上，鸭梨侵染链格孢菌和侵染链格孢菌是美国学者R.G.Roberts从鸭梨果实上分离并命名的两个新种［27-28］，李丙新等［29］、张志铭等［30］也从不同国家的梨中分离出以上五种链格孢菌。对其病害的研究主要是造成梨果黑斑病发生，对这五种菌的次生代谢产物并未做详细的分离鉴定，五种病原主要寄主以梨果为主。

本研究分离并鉴定了梨黑斑链格孢菌（Alternaria gaisen）的6个次生代谢产物，得到6个毒素化合物，其中4个为毒素。根据万佐玺等［31］研究链格孢菌是一种兼性寄生的真菌，在不同的寄主上产生的代谢毒素可能存在专化性和非专化性的区别，但是以不同的营养基质作为发酵条件，分离鉴定梨黑斑链格孢菌的毒素成分均为非专化性毒素。分析梨黑斑链格孢菌的产毒情况，初步结果得到了梨黑斑链格孢菌尽管在不同营养基质条件下，存在产毒含量的差异，但毒素种类并没有显著区别。是否与寄主及致病性有关，尚不清楚。