基于PARMS技术的抗稻瘟病基因Pigm分子标记的开发

2018-09-11卿冬进刘开强杨燕宇高利军戴高兴周维永梁海福邓国富

西南农业学报 2018年8期

卿冬进，刘开强，杨燕宇，高利军, 黄娟, 高菊, 戴高兴, 周维永,梁海福, 邓国富 *

(1. 广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室，广西南宁 530007；2. 广西农业科学院，广西南宁 530007；3. 武汉市景肽生物科技有限公司，湖北武汉 430075； 4. 广西农业科学院水稻研究所，广西南宁 530007)

【研究意义】水稻是全世界重要的粮食作物之一，养育了全球约50 %的人口[1]。水稻稻瘟病(rice blast)是由子囊菌(Magnaportheoryzae)引起的真菌危害性病，是影响水稻的产量最大的病害之一，严重时使水稻减产40 %～50 %，甚至达到颗粒无收的程度[2-3]。目前农业生产上控制稻瘟病害方法主要是化学防治和种植抗稻瘟病品种防治。化学防治方法虽然在一定程度上能减少稻瘟病对水稻产量的损失，但是大量使用农药会造成田间环境污染，甚至增加稻米的农药残留量，种植抗病水稻品种是防治稻瘟病爆发的最经济、安全的方式[4]。目前，普通的分子标记方法用于抗性品种育种过程中基本都需要耗时的DNA电泳分析，因此，利用PARMS技术建立抗稻瘟病基因Pigm的荧光分子标记，可为抗稻瘟病水稻品种分子育种提供简便、可靠的基因分型检测方法，对培育稻瘟病抗性水稻品种具有实际研究意义。【前人研究进展】PARMS(Penta-primer amplification refractory mutation system)技术，是一种基于扩增受阻突变体系PCR(ARMS-PCR，Amplification Refractory Mutation System Polymerase Chain Reaction)检测技术[5]，其原理是：在ARMS-PCR基础上增加了两条带有不同荧光的检测引物，可以分别检测两条等位基因正向引物5’端的互补序列，经过与同一条反向引物PCR扩增以后，待测位点的多态性即可通过不同的荧光信号检测出来。目前为止，至少报道了69个抗稻瘟病位点，共有84个主效基因[6]，其中Pi1[7]、Pi2[8]、Pi9[9]、Pigm[10]、Pid3[11]、Pizt[8]、Pi56[12]、Pia[13]、Pib[14]、Pita[15]等25个抗稻瘟病基因已被克隆。分子标记辅助选择(Marker-assisted selection，MAS)技术具有高效、安全、可靠的优点，在水稻的分子育种上改良个别性状的应用越来越广泛[16]。抗稻瘟病基因在分子标记辅助育种上的应用越来越广泛，如Pib[17]、Pi-d2[18]、Pita[19]等抗性基因分子标记已经用于分子育种上。Pigm基因来源于水稻品种谷梅4号中的一个持久广谱抗稻瘟病基因，已被定位到水稻第6染色体短臂上靠近Pi2/9位点[10]，该基因由多个NBS-LRR类抗病基因组成，其中PigmS和PigmR是2个有功能蛋白，它们通过竞争形成异源二聚体，使PigmR的致病性进化减慢，从而达到持久抗病[20]。目前Pigm基因已被越来越多的水稻育种研究者用于分子标记辅助选择技术进行抗稻瘟病水稻品种选育。梁毅等[21]根据Pigm在谷梅4号和9个籼稻亲本的多态性筛选获得共显性InDel标记DG-3，并利用该标记在回交群体中选择到包含目的基因的单株。杨平等[22]利用分子标记辅助选择技术将谷梅4号的Pigm基因回交导入到感病的春恢350中，获得了3个带有目标基因的改良纯化株系，经过菌株接种实验鉴定，导入系的抗性频率达到85 %～100 %。田红刚等[23]利用杂交、回交、分子标记辅助选择技术将Pigm基因导入粳稻品种空育131、垦鉴稻6和龙粳26中，大幅度提供了对稻瘟病的抗性，抗性频率达到95.2 %～98.4 %。张礼霞等[24]利用分子标记辅助选择技术将Pigm基因导入浙04B中，获得了23份近等基因系材料，对人工接种4个浙江省稻瘟病优势菌株和自然诱发鉴定均表现为抗穗颈瘟。吕学莲等[25]以谷梅4号和粳稻材料MP3为供体，利用花粉管通道技术将其基因组DNA导入SD-2、SD-3、DJ13等品种，并利用Pigm基因的显性标记进行检测，筛选到的目标基因导入的阳性植株107株进行进一步加代培育与辅助选择。最近研究报道表明利用分子标记辅助选择方法将Pigm基因用在改良水稻品种稻瘟病抗性方面具有优越的应用价值。【本研究切入点】利用PARMS技术开发了Pigm基因荧光分子标记，经PCR扩增、荧光扫描后快速获得基因分型结果，摆脱了琼脂糖电泳对PCR产物检测的繁琐工作。【拟解决的关键问题】利用抗稻瘟病基因Pigm序列与其等位基因Pi2、Pi9及感病品种日本晴中的等位基因的序列差异，结合PARMS技术建立共显性荧光分子标记PM-Pigm的方法，对48份水稻亲本材料的Pigm基因型及其稻瘟病抗性进行研究，拟解决运用普通分子标记过程中费时的问题，为利用抗稻瘟病基因Pigm分子标记快速进行基因分型提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料为广西农业科学院作物遗传改良生物技术重点开放实验室提供的48个水稻亲本材料(表3)。供试稻瘟病菌株来源于广西壮族自治区岑溪市稻瘟病区的2个单胞分离培养菌株。经过接种中国鉴别寄主测试，分别为菌株ZB1和ZB13。

1.2 稻瘟病苗瘟抗性评价

48个水稻亲本种子经浸种2 d，催芽1 d后播种到装有肥泥的搪瓷盆内(52 cm×37 cm)，每个接种的菌株播一盆，每个亲本材料播种12粒，加水湿润管理。待生长到一叶一心时对每盆施尿素2.5 g；待秧苗生长到3叶期，去除弱苗，每盆再施尿素2.5 g；待秧苗生长到4叶期，在接种箱内用喷雾接种方法将稻瘟病菌分生孢子接到秧苗上，每盆苗接种一个菌株，菌液量45 ml，待孢子沉降后将秧苗转移到28 ℃的黑暗保湿箱内放置24 h，然后将秧苗转移到保湿篷内再保湿5 d，接种7 d后进行调查分析，稻瘟病情分析依据IRBN[26]标准进行抗性分级，0～2级为抗(R)，3级为中抗(M)，4～9级为感(S)。

1.3 水稻叶片组织基因组DNA提取

2018年4月23日，采取种植于广西农业科学院内水稻田的48个水稻亲本材料叶片，参考Murray等[27]的CTAB方法提取新鲜水稻叶片组织的基因组DNA。提取到的基因组DNA溶解在TE缓冲液中用于后续的等位基因检测实验。

图1 Pigm基因中用于标记开发的序列等位分析结果Fig.1 Allelic analysis result of Pigm gene for maker development

表1 标记引物序列

1.4 等位基因型检测方法

PCR扩增反应体系10 μl，体系包含：5 μl 2×PARMS master mix(包含2条通用荧光引物)，0.15 μl 10 mMAllele-T标记引物，0.15 μl 10 mM Allele-C标记引物，0.4 μl 10 mM Common-R通用反向引物，1 μl模板DNA (10～100 ng)，3.3 μl ddH2O。PCR反应程序为94 ℃，3 min；然后10个循环94 ℃，20 sec，65 ℃ (-0.8 ℃每循环)，1 min；然后30个循环94 ℃，20 s，57 ℃，1 min。将PCR产物在包含FAM、HEX和ROX 3种荧光检测通道的酶标仪中进行快速检测，读取荧光强度信号值，然后将荧光信号值文件通过SNP decoder(http://www.snpway.com/snpdecoder01/)工具，结合标记信息，自动进行基因分型，获得基因型结果。

2 结果与分析

2.1 分子标记引物设计

利用抗稻瘟病基因Pigm序列与其等位基因Pi2、Pi9及感病品种日本晴中的等位基因的序列差异(图1)，设计其共显性分子标记PM-pigm，其引物序列见表1。Pigm序列等位分析结果显示谷梅4号中的序列跟Pi2、Pi9及日本晴中的等位基因的序列差异为T/C(图1)，因此利用差异的SNP设计为标记引物的3’末端。标记引物Allele-T能跟PARMS master mix中的HEX荧光引物匹配结合，而Allele-C能跟PARMS master mix中的FAM荧光引物匹配结合，从而根据不同的荧光信号获得不同的基因型(表2)。根据序列比较结果分析，预测PCR反应后，谷梅4号的Pigm基因扩增一定可以检测到HEX荧光信号，其它无稻瘟病抗性的亲本材料的等位基因扩增可以检测到FAM荧光信号，从而将Pigm在抗性品种的基因型与感病品种的基因型区分开。

表2 等位基因与荧光标记对应表

2.2 分子标记PM-Pigm检测Pigm及等位基因在水稻亲本中的分布

利用设计的荧光分子标记PM-Pigm检测了48个水稻亲本材料的基因型，PCR扩增后，经过荧光扫描仪扫描，分析结果显示仅在谷梅4号中检测到HEX荧光信号，其它47个水稻亲本都检测到FAM荧光信号(图2)。结合引物设计的原理分析，谷梅4号中存在Pigm抗性基因的等位基因型为纯合TT，另外47个水稻亲本材料中没有检测到HEX荧光信号，因此不存在Pigm抗性基因型TT。结果显示47个亲本中检测到FAM荧光信号，其存在等位基因型为纯合CC。

图2 PM-Pigm对48份水稻亲本的基因分型检测结果Fig.2 Genotyping result of 48 rice germplasm by using PM-Pigm

表3 水稻亲本材料对稻瘟病的抗性及PM-Pigm分子标记检测结果

注： “+”代表有Pigm基因HEX荧光信号，“-”代表其等位基因FAM荧光信号。

Notes:‘+’ indicate HEX fluorescence ofPigmgene, ‘-’ indicate FAM fluorescence of its allele.

2.3 水稻亲本对稻瘟病的抗性评价分析

48份水稻亲本材料经过接种菌株ZB1和ZB13后，对水稻秧苗的叶瘟抗性水平进行分级评价。分析结果显示(表3)，谷梅4号对ZB1和ZB13两个稻瘟病菌株都表现为抗(R)，与上述用PM-Pigm分子标记检测到谷梅4号有Pigm基因相关。而佳福B、Lement、大玉23、浙桂87、My46和三黄占2号也对两个稻瘟病表现为抗(R)，这些品种中可能存在其它的稻瘟病抗性相关基因。龙丰B、美B、宇19B等其中一个稻瘟病菌株表现为抗(R)或者中抗(M)的也可能存在其它稻瘟病抗性相关基因。158B、秋B、博B等对ZB1和ZB13均表现为感(S)，表明这些品种里面没有Pigm抗性基因，也没有抗这两个菌株的其它抗性基因存在。

3 讨论

分子标记辅助选择技术已广泛用于作物育种生产上，其优点是能够快速、精准跟踪目标现状基因，且不受环境因子影响[28]。来源于谷梅4号的抗稻瘟病基因Pigm已成功被部分育种研究者用于改良杂交水稻的稻瘟病抗性。梁毅等[21]利用Pigm共显性InDel标记DG-3开展稻瘟病抗性分子育种，获得了9个籼稻组合的BC3F1群体。王飞等[29]利用Pigm的InDel标记S95477和S29742进行分子标记辅助选择，获得了82个含有Pigm基因的株系。此类普通的Pigm分子标记主要依赖于琼脂糖电泳或PAGE胶电泳分析，而本研究利用PARMS方法建立的Pigm荧光分子标记不需要进行电泳分析。该标记能准确检测到水稻品种谷梅4号中的Pigm对应的荧光信号，与普通的Pigm分子标记相比较，具有简便、高效的优越性，采用荧光扫描方法直接获取到等位基因的基因型信号，结合数据分析软件，可以快速完成大规模材料的基因型分析，同时可以对大批量的SNP标记和样品进行精准的双等位基因验证和检测，达到高通量进行基因分型的效果。

本研究对48份水稻亲本的抗稻瘟病分级评价试验中，谷梅4号具有对两个来源于广西壮族自治区岑溪市的稻瘟病菌株都表现抗(R)，且分子标记检测到Pigm的抗性荧光信号，基因型与抗性表型一致，而其它一些品种如佳福B、My46、浙桂87等虽然没有检测到Pigm的抗性荧光信号，但是对2个菌株都表现抗(R)，可能跟存在其它抗稻瘟病基因Pi2、Pi5或Pita相关[30]。Lement、大玉23品种也对两个稻瘟病菌株均表现为抗(R)，可能这些地方抗性品种还存在待挖掘的抗稻瘟病抗性基因。由于自然界稻瘟病菌具有快速、多样化变异特性，导致水稻在不同环境下抗性不稳定[31]。因此，在同一水稻品种中通过分子标记方法聚合多个抗稻瘟病基因，是培养广谱、持久抗稻瘟病品种的有效途径[32]。通过PM-Pigm荧光分子标记对亲本材料的基因分型检测，并结合稻瘟病抗性表型试验，证明了该荧光分子标记的可靠性，为利用Pigm基因用于分子育种研究提供了高效的基因分型技术。