阿尔茨海默病与维生素D受体基因遗传变异的关联分析

史曜维， 庄晓伟， 朱 磊， 王稀琛， 刘 寒

阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)，又称老年性痴呆，是一种不可逆的中枢神经退行性疾病，临床主要表现为认知功能下降、精神症状和行为障碍、日常生活能力的逐渐下降[1]。AD发病隐匿，病程长且预后较差，目前已成为继心脑血管疾病、恶性肿瘤之后的第3位危害人类健康的重要慢性非传染性疾病。流行病学调查显示，全球范围内已有超过3500多万的AD患者[2]，并且这个数字还会以每3 s增加1名的速度上升。中国人口老龄化日益严重，AD已成我国人民健康的巨大挑战。AD可能是一组异质性疾病，在多种因素(包括环境因素、遗传因素以及社会心理因素)的作用下才发病。多项临床实验研究报道了AD患者体内普遍存在维生素D缺乏的现象[3，4]。此外，基础研究亦发现维生素D在AD的病理过程中发挥重要作用，然而，其具体机制尚不清楚。维生素D与维生素D受体(Vitamin D receptor,VDR)结合而发挥作用。国外已有关于VDR基因遗传多态与AD发病关联研究的探索。Gezen-Ak等[5]在高加索人群中首次发现了VDR基因ApaI位点多态性与AD的发病存在关联。目前，在我国汉族人群中尚未开展AD与维生素D受体基因遗传变异的关联分析。为此，本研究结合国外已有的研究进展，采用基于医院的病例对照研究，探讨AD与维生素D受体基因遗传变异的关联。

1 对象与方法

1.1 研究对象 AD组：随机选取于2013年1月-2017年12月在上海市静安区精神卫生中心门诊收治且诊断为AD患者263例，纳入标准：(1)所有病例均符合NINCDS/ADRDA的诊断标准；(2)年龄18～70岁；(3)自愿作为研究对象，保证完成研究过程。排除标准：(1)其他非AD痴呆患者；(2)年龄在18岁以下或70岁以上；(3)有脑创伤、脑损害病史，或正在服用抗精神病药物。所有研究均为无血缘关系的人群，且排除孕妇、哺乳妇女者。健康对照组：选自本单位同时期参加体检的健康人群591例，按照年龄、性别等因素与AD组相匹配。本研究获得了本单位伦理委员会的批准，且严格遵守伦理学的各项规定。

1.2 调查方法 参照相关文献自行设计《AD调查表》进行现场询问调查，在研究对象知情同意的前体下由经过培训的调查人员对研究对象进行询问调查，调查内容包括基本情况(年龄、性别、吸烟、饮酒等);既往疾病史(慢性疾病史、传染病史、其他疾病史等)。

1.3 实验方法 经知情同意后，抽取研究对象EDTA抗凝静脉血5 ml，并在24 h内4000转离心10 min，将静脉血分离成血清层、白细胞层和红细胞层，分装于1.5 ml冻存管，置-20 ℃贮存。血清25(OH)D3水平的检测采用ELISA法，试剂盒购自上海斯凯科技有限公司。所有实验的具体操作均严格按照说明书进行。从NCBI、HapMap等数据库中寻找和确认VDR基因的SNPs位点，选择在中国人群具有较高频率(MAF≥ 5%)，再结合国内外文献报道[5～7]，最终确定了FokI和ApaI两个位点。运用ABI公司设计的TaqMan-MGB荧光探针实时定量PCR法检测FokI和ApaI位点基因型，FokI位点野生纯合型为FF，杂合型为Ff，突变纯合型为ff，ApaI位点野生纯合型为AA，杂合型为Aa，突变纯合型为aa。探针和引物均委托上海科迈生物技术公司设计。反应在ABI 7900 PCR仪中进行，采用SDS 2.3软件读取检测数据。

1.4 统计学分析 应用EpiData 3.10、SAS 9.1.3、SPSS 17.0和PHASE 2.0软件对调查和实验数据进行分析，健康对照和AD组中性别、吸烟、饮酒分布情况采用卡方检验，年龄分布差异采用t检验，血清25(OH)D3水平分布不符合正态分布，故采用秩和检验方法。VDR基因位点在人群中分采用多因素Logistic回归分析。本研究的检验均为双侧概率检验，当P<0.05时有统计学意义。

2 结 果

2.1 研究对象的一般情况 本研究共纳入263例AD患者和591例健康对照者。两组人群在性别和年龄分布上无统计学差异(P值分别为0.58和0.28)。血清25(OH)D3水平在两组间的分布差异具有统计学差异(P<0.01)(见表1)。

2.2 VDR基因SNPs位点多态性与AD遗传易感性的关系 多因素Logistic回归分析显示：在调整年龄、性别等因素后，与FF基因型相比，FokI位点的Ff可以显著增加个体AD的发病风险(调整OR=1.65，95%CI=1.18～2.32)；我们并没有发现ApaI位点多态性与AD的发病风险存在显著关联。显性模型显示：与FF基因型相比，FokI位点的变异基因型Ff/ff可以显著增加AD的发病风险(调整OR=1.61，95%CI=1.16～2.21)，而ApaI位点Aa/aa基因型与AA相比，并未发现该基因型与AD发病风险存在关联(调整OR=1.17，95%CI=0.87～1.57)(见表2)。

2.3 单倍型分析 FokI和ApaI两个位点组成的单倍型共有4中形式，即FA、Fa、Af、af。研究结果显示与fa单倍型相比，Fa单倍型在AD组的分布显著低于健康对照组(调整OR=0.66，95%CI=0.51～0.85)(见表3)。

2.4 VDR基因FokI位点基因型分布与血清25(OH)D3水平的关系 采用方差分析方法，分析VDR基因FokI位点基因型分布与血清25(OH)D3水平的关系。结果显示，在AD组和健康对照组中，FokI位点不同基因型分组中血清25(OH)D3水平有统计学差异(F=3.15，P=0.04)(见表4)。

表1 AD组与健康对照组之间一般情况的比较

注：*25(OH)D3在AD组合健康对照组中的分布存在统计学差异

表2 VDR基因多态性与AD遗传易感性的关系

注：调整因素分别为年龄、性别、吸烟和饮酒。*基因型在AD组合健康对照组中的分布存在统计学差异

表3 VDR基因SNP位点单倍型分析与AD发病的关联

注：调整因素分别为年龄、性别、吸烟和饮酒。*单倍型在AD组合健康对照组中的分布存在统计学差异

表4 两组人群中FokI不同基因型血清25(OH)D3水平分布差异

注：*在AD组和健康对照组中，FokI位点不同基因型分组中血清25(OH)D3水平有统计学差异

3 讨 论

目前，关于AD的发病机制还处于研究阶段，但遗传因素已被证实在AD的发病过程中起到重要作用。其中，载脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)基因、补体受体1(complement receptor 1,CR1)基因已相继被证实与AD的发病存在关联[6，7]。随后，全基因组关联研究(genome-wide association studies,GWAS)、Meta分析等研究也发现和验证了一系列基因遗传变异与AD的发病存在关联。迄今为止，仅有少数国外研究发现VDR基因多态性可能与AD发病存在关联[8，9]。本研究首次在汉族人群中探讨了VDR的2个多态性位点(FokI和ApaI)与AD发病的关联，并发现FokI位点多态性可能与AD的发病发展存在关联。

维生素D除了可调节血清钙水平外，还参与机体抗氧化水平、减轻抗氧化水平、清除自由基以及保护神经元等反应[10]。因此，机体血清维生素D水平可能参与了AD的发生、发展等过程。此外，维生素D与胶质细胞源性神经营养因子的合成和表达也有关，这更加提示维生素D可能对退行性神经病变有一定的应用价值。多项研究发现，AD患者血清维生素D水平普遍低于健康人群[3，4]。本研亦发现AD患者血清维生素D水平低于健康对照者，表明机体血清维生素D水平确与AD的发病风险存在关联，且AD患者普遍存在缺乏维生素D的现象，这对AD临床诊断具有一定的指导意义。

VDR作为一种配体激活转录因子在脑组织中广泛表达，主要与维生素D形成维生素D-VDR的复合物，后者与存在于靶基因序列上的反应元件(vitamin D response element,VDRE)结合反应物，从而改变靶基因mRNA的水平[11]。VDR可能通过调节维生素D生物学功能间接影响AD的发病，而VDR的表达受控于VDR基因多态性。VDR基因可表达在神经细胞和神经胶质细胞中，其基因多态性直接影响着维生素D与其受体结合的亲和性[12]，从而可能影响着AD的发病、进展以及预后。Gezen-Ak等[5]首次开展了VDR基因变异与AD发病关联的研究，发现了ApaI位点多态性可能与AD的发病存在关联。随后，Khorram Khorshid HR等[8]继续在晚期AD患者中检测VDR基因其他位点基因型的分布情况，未发现FokI、TaqI、BsmI等位点与AD的发病存在关联。这一研究结果与本次研究结果完全相反。

在本研究中，笔者发现FokI位点的Ff可以显著增加个体AD的发病风险，其变异基因型Ff/ff亦可显著增加VD的发病风险。然而，未发现ApaI位点多态性与AD的发病风险存在关联。与Gezen-Ak等研究结果不一致的原因可能是由于基因在不同人群中分布差异导致。Khorram等[13]在伊朗人群中也未发现ApaI位点多态性与AD的发病风险存在关联，这一结果与本研究一致，可能也是由于伊朗人群与汉族人群同为亚洲人群。在单倍型研究中，我们亦发现，与fa单倍型相比，Fa单倍型在AD患者中的分布显著低于健康对照组，由此可见，FokI位点多态性在VDR基因变异中发挥着重要作用，且这种作用在一定条件下起到主导作用。

综上，VDR基因变异对VD遗传易感性可能有不可忽视的作用，其可影响VD发生、发展的临床结局。本研究在该领域尚属首次，也存在一些不足，如样本量不够多、研究对象全部来自医院，存在选择偏移等。因此，还需进一步扩大样本量，在其他人群中进行验证。除此之外，环境相关的因素与遗传因素联合作用对VD致病机制中的影响值得深入探索。