Noggin阻断BMP-7/Smad信号通路对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖及IL-6、IL-8表达的影响

方芳，丁爽，吴春玲，段宏梅，刘海娜，肖卫国

（中国医科大学附属第一医院风湿免疫科，沈阳 110001）

类风湿关节炎 （rheumatoid arthritis，RA） 是主要累及关节的自身免疫性炎症性疾病，基本病理改变是滑膜炎［1］。滑膜细胞异常增殖引起关节骨、软骨及软组织结构破坏，导致关节功能受损、受累个体生活质量下降，甚至致残。除了传统的抗风湿药物，针对肿瘤坏死因子α （tumor necrosis factor α，TNF-α）、白细胞介素6（interlukin 6，IL-6）等的生物制剂越来越多应用于临床，进而改善骨质，延缓了关节结构损伤［2］。但由于RA疾病本身的异质性，现有治疗并不都能得到满意的疗效。因此，越来越多的研究试图寻找新的治疗靶点来干预RA的发病过程。

骨形态发生蛋白（ bone morphogenetic protein，BMP） 属于转化生长因子β（ transforming growth factor，TGFβ-） 超家族［3］。除了具有异位成骨能力，还参与胚胎发育，具有维持组织稳态等多种生物学功能［4］。本课题组前期研究发现BMP-7对体外培养的RA 成纤维样滑膜细胞（ fibroblast-like synoviocytes，FLS） 增殖具有促进作用，现应用Noggin拮抗BMP-7，阻断BMP-7/Smad通路，观察RA FLS增殖及炎性细胞因子IL-6、IL-8 mRNA表达，为进一步阐明BMP-7/Smad通路在RA滑膜炎症调控中的作用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 RA滑膜组织标本：滑模标本取自中国医科大学附属第一医院关节外科住院行关节镜下滑膜切除术的RA患者的膝关节滑膜，诊断符合1987年ACR修订的RA分类标准，其中男2例，女1例。标本获取均征得患者本人知情同意。

1.1.2 主要试剂：Recombinant Human Noggin、Recombinant Human BMP-7（ 美国Peprotech公司） ，EliVisionTMplus试剂盒（ 福州迈新生物技术公司） ，PMll640、高糖DMEM培养基、消化用胰酶（ 美国Gibco公司） ，血清（ 美国Hyclone公司） ，Cell CountingKit-8 （ 日本Dojindo公司） ，PCR引物（ IL-6 正义链，ACCGTCATCATG TCTGACCA；反义链，TGGAACACCCTGTCTTTGAC。IL-8 正 义 链，ACCGTCATCATGTCTGACCA；反 义链，TGGAACACCCTGTCTTTGAC，上海生工公司） ，RNAiso plus、RT-RNA反转录试剂盒、RT-PCR试剂盒（日本TaKaRa公司）。

1.2 方法

1.2.1 RA FLS培养与鉴定：将手术室无菌获取的滑膜组织置于含有培养液的无菌容器中，置于冰盒内，转移至超净台内操作。去除脂肪组织和纤维组织，用磷酸盐缓冲液（ PBS）清洗3～5次，用眼科剪反复剪切成糊状，于无菌培养皿中加入Ⅱ型胶原酶（ 1 mg/mL） ，37 ℃、消化2～4h，过滤、离心去上清，将细胞重悬于达氏修正液（ DMEM培养液） ，37 ℃、5%CO2细胞培养箱内分装培养。显微镜下观察细胞形态及生长情况，当细胞长成梭形并成片后，进行传代培养。RA FLS鉴定采用波形蛋白vimentin及CD68免疫组化法。实验用3～7代细胞。

1.2.2 细胞增殖实验：将3～7代RA FLS接种到96孔板中 （1×104/孔） ，共4板，于37 ℃、5%CO2培养箱中孵育12 h，弃培养液；将BMP-7 （终浓度200 ng/mL） 和Noggin （终浓度为0、0.1、0.2、0.4、0.8 μ g/mL） 配置到培养液中，每个BMP-7浓度设3个复孔，继续培养0、24、48、72 h后分别取出1个96孔板，加入20 μ L CCK8试剂，置于37 ℃、5%CO2培养箱中继续培养4 h，置摇床上低速振荡约10 min，酶标仪上检测波长450 nm下每孔的吸光度值，然后根据数值做增殖曲线。

1.2.3 实时PCR检测IL-6、IL-8 mRNA：取BMP-7 （终浓度分别为0、25、50、100、200 ng/mL） 及BMP-7 （终浓度为200 ng/mL） +Noggin （终浓度为0、0.1、0.2、0.4、0.8 μ g/mL） 培养RA FLS 24 h，按照试剂盒操作说明分别测定IL-6、IL-8 mRNA表达，使用ABI RQ manager软件分析数据。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 Noggin阻断BMP-7/Smad通路对RA FLS增殖的影响

BMP-7 （200 ng/mL） 联合Noggin培养RA FLS，随Noggin浓度增加，BMP-7促进RA FLS增殖作用减弱。在 培 养48、72 h，0.4及0.8 μ g/mL Noggin对RA FLS的增殖抑制作用与对照组 （Noggin 0 μ g/mL） 比较，差异有统计学意义 （P ＜ 0.05） ；当Noggin浓度为0.8 μ g/mL时，对增殖的抑制作用最强 （P ＜ 0.05） ，见表1。

2.2 阻断BMP-7/Smad通路对IL-6、IL-8 mRNA表达的影响

结果显示，BMP-7上调RA FLS炎性细胞因子IL-6、IL-8 mRNA表达，且随浓度上升呈下降趋势 （P ＜ 0.05） ，见表2。阻断后，当Noggin浓度为0.8 μ g/mL时，能够较好拮抗BMP-7 （浓度200 ng/mL） ，下调IL-6、IL-8 mRNA表达，见表3。

3 讨论

BMP作为重要的成骨因子，在各种类型的关节炎研究中有很多报道［5］。关于BMP-7与软骨细胞代谢研究［6］发现，BMP-7通过刺激细胞外蛋白及受体、调节生长因子，同分解代谢有关的细胞因子共同调节软骨细胞代谢。在关于RA的动物实验［7］也发现有BMP/Smad通路活化。同TGF-β相似，BMP信号通路通过跨膜丝氨酸-苏氨酸激酶受体 （Ⅰ型、Ⅱ型BMP受体） 发挥作用。BMP二聚体配体与BMPⅠ或Ⅱ型受体结合，显著活化下游信号，参与Smad家族成员分子或丝裂原活化蛋白激酶活化过程［8］。

表1 不同浓度Noggin阻断BMP-7/Smad通路对RA FLS增殖的影响Tab.1 Effect of blocking BMP-7/Smad pathway with different concentrations of Noggin on the proliferation of RA FLS

表2 BMP-7 对RA FLS炎性细胞因子IL-6 、IL-8 mRNA表达的影响Fig.2 Effect of BMP-7 on the expression of IL-6 and IL-8 mRNA in RA FLS

表3 不同浓度Noggin对BMP-7诱导IL-6 、IL-8 mRNA表达的影响Tab.3 Effect of different concentrations of Noggin on the expression of IL-6 and IL-8 mRNA induced by BMP-7

BMP信号通路通过配体多样性、细胞外BMP拮抗剂分泌、I-Smads以及核协阻遏物和共活化物等在不同水平被调节［9-10］。BMP拮抗剂包括Noggin、Chordin、Follistatin、Dan/Cerberus家 族、Gremlin、Dante、Sclerostin和Chordin样 蛋 白［11］。其 中Noggin是典型的BMP拮抗剂，可阻滞BMP与其相应的受体结合，抑制其信号传导通路。在胶原诱导的关节炎 （collagen-induced arthritis，CIA） 鼠关节滑膜中，Noggin表达在0～20 d稳定在一定水平，在20 d后逐渐下降［12］。除了关节疾病，在其他多种疾病［肥胖症、糖尿病、进行性骨化性纤维发育不良 （fibrodysplasia ossification progressive，FOP） 、原发性肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension，PAH） 、遗传性出血性毛细血管扩张症 （hereditary hemorrhagic telangiectasia，HHT） 、肿瘤］中同样存在着BMP信号通路异常。上述疾病研究发现，BMP/Smad通路在维持血管稳定性中发挥作用，并且信号转导高度依赖于其内分泌及循环特性。但关于BMP及其受体，以及信号通路在关节炎性疾病以及上述疾病中的发病机制尚未完全明确。

前期研究［13］发现RA患者血清中BMP-7水平升高，同疾病活动相关，并且体外实验发现BMP-7在关节炎症部位高表达，促进RA FLS增殖。为了进一步研究BMP-7/Smad信号通路是否参与RA FLS增殖过程，选择Noggin作为BMP-7/Smad通路阻断剂，进行信号通路阻断的实验研究。结果发现，BMP-7对RA FLS增殖促进作用减弱，并且RA FLS表达炎性细胞因子水平降低，提示其发挥作用可能是通过阻断BMP-7/Smad信号通路。故推测BMP-7可能是通过Smad依赖性通路，促进关节修复，但其表达增多可能对关节炎症有促进作用，拮抗其表达有助于炎症状态的控制。

BMP-7对炎性细胞因子虽然有促进作用，但同前期研究相比 （TNP-α促进RA FLS炎性细胞因子产生） ，炎性细胞因子整体表达水平偏低，说明其促炎作用是有限的。实验仅研究了体外培养的RA FLS，BMP-7对RA滑膜中的其他细胞有怎样的影响尚不明确，有待进一步研究确证。Noggin作为BMP-7拮抗剂，在一定浓度下有可能拮抗BMP-7对关节的破坏作用。虽然目前研究尚不足以证实单纯BMP信号通路异常可诱发RA疾病病理过程，但BMP-7或是其他拮抗剂有可能在关节炎症过程中动态变化［14］，并通过Smad通路在RA滑膜炎症调控中发挥作用。靶向BMP-7/Smad信号通路分子能否成为改善RA患者关节炎症的治疗手段，尚需要进一步精确的信号通路实验研究证实。