转化生长因子β信号在内皮细胞中通过上调ULK1蛋白抑制细胞周期

康伊，张艳，张伟

（辽宁中医药大学 1. 研究生学院； 2. 附属医院心血管内科，沈阳 110032）

慢性心力衰竭 （chronic heart failure，CHF） 患者通常由于血流动力学压力增加，导致心脏病理性重塑而引发心功能逐渐恶化［1］。之前多项研究［2-3］表明，转化生长因子β （transforming growth factor β，TGF-β） 家族蛋白与心脏重塑和心力衰竭高度相关。在心力衰竭过程中，TGF-β信号一方面抑制血管内皮细胞的增殖、迁移和血管生成，另一方面则促进平滑肌细胞的增殖和纤维化。抗肿瘤药阿霉素的心脏毒性就是由于阿霉素激活TGF-β表达，从而抑制血管内皮细胞增殖而引发的［4］。早期研究［5］认为，TGF-β信号抑制内皮细胞增殖的生物机制主要是TGF-β促进细胞周期抑制因子p15INK和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子 （CDK inhibitor，CKI） 的表达。近期有研究［6］发现，细胞自噬关键蛋白激酶ULK1可磷酸化细胞周期分子伴侣Cdc37并导致CDK4和AuroraB的降解，从而抑制细胞周期。本研究发现，TGF-β信号通路能够在内皮细胞中特异性上调ULK1蛋白表达，上调作用是通过促进ULK1蛋白合成实现的，敲低ULK1表达可导致内皮细胞增殖加快和S/G2期细胞比例明显提高。这提示ULK1蛋白可成为TGF-β信号通路调控内皮细胞增殖的新靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

人脐静脉内皮细胞 （human umbilical vein endothelial cells，HUVEC） 、人微血管内皮细胞 （human microvascular endothelial cells 1，HMEC-1） 和人胚胎肾细胞 （human embryonic kidney 293T，HEK293T） 购自ATCC。HMEC-1细胞培养于含10% 胎牛血清 （fatal bovine serun，FBS） 的DMEM 培养基内，37 ℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养。HUVEC 细胞从液氮冻存罐中取出，置于37 ℃水浴中迅速解冻，将细胞转移至离心管中，加入4 mL含10% FBS 的1640 完全培养基，充分混合，1 000 r/min离心3 min。用5 mL 1640完全培养基重悬于37 ℃、5% CO2的条件下静置沉淀，6 h 细胞贴壁生长后换液。在培养3～6代时进行TGF-β处理实验。

1.2 细胞转化和稳定表达细胞系构建

构建针对人源ULK1 shRNA的pCDNA3.1质粒，shRNA 序列为 5’-GCACAGAGACCGTGGGCAA-3’，利用Lipofectamine2000 （Invitrogen） 将质粒转染至HMEC-1细胞中，并用800 μ g/mL 的G418进行筛选。1个月后用无菌枪头挑取阳性单克隆进行扩增培养，利用Western blotting验证敲低效率，并以筛选转染pCDNA3.1空质粒的HMEC-1细胞作为对照。

1.3 免疫印迹实验

等量的上样蛋白经8%SDS-PAGE 分离胶和5%浓缩胶分离后，半干转印至硝酸纤维素膜上，用含5% BSA 的TBST 室温封闭2 h，加入一抗4 ℃孵育过夜。用0.1% TBST 洗膜3 次，每次15 min，加入相应的HRP 标记的二抗，室温孵育1 h。0.1% TBST 洗膜后以Supersignal West Femto/Pico HRP 敏感化学发光底物对条带进行显色。以Tubulin蛋白作为内参对照。

1.4 细胞流式分析实验

将TGF-β处理过的HMEC-1细胞用PBS 洗涤1～2次后，加入1 mL 含0. 25%胰酶的细胞消化液，于37℃条件下消化15 min。消化完全后加入20 μ L 胎牛血清终止消化反应，2 000 r/min离心5 min，去除上清液，下层细胞用PBS 洗涤1 次，弃上清液，缓慢加入1 mL 体积分数为70%的冰乙醇溶液，吹吸均匀后置于4 ℃冰箱中固定24 h。固定后细胞离心洗涤2～3次，加入5 μ L RNA酶37 ℃水浴30 min，离心弃上层清液，缓慢加入0. 4 mL PBS 溶液吹吸均匀，加入5 μ L 碘化丙啶染液，4 ℃染色0.5 h 后上机检测。使用流式细胞仪 （ BD FACS Calibur） 进行检测，依据检测情况设定FSC-Height 等参数。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 TGF-β在血管内皮细胞中上调ULK1蛋白表达

在HUVEC和HMEC-1细胞中分别加入2 ng/mL TGF-β处理内皮细胞6 h，利用Western blotting 检测ULK1蛋白的表达水平，发现TGF-β能够明显上调ULK1蛋白的表达 （图1A、B） 。利用ShRNA在HMEC-1细胞中构建稳定敲低ULK1基因的细胞株，表明TGF-β在HMEC-1细胞中上调ULK1表达的特异性（图1C） 。同时TGF-β上调ULK1具有细胞特异性，在上皮细胞系HEK293T中TGF-β不能刺激ULK1的表达（图1D） 。TGF-β上调ULK1表达主要通过增加蛋白合成的方式，利用放线菌酮 （cycloheximide，CHX） 处理可在HUVEC细胞中抑制TGF-β对ULK1的上调作用（图1E） ，而在HMEC-1细胞中TGF-β以浓度依赖方式不断增强ULK1的表达 （图1F） 。

2.2 ULK1参与抑制血管内皮细胞的细胞周期

通过构建稳定敲低ULK1基因的HMEC-1细胞株，并用流式细胞仪分析同步化后ULK1基因敲低型和野生型内皮细胞的细胞周期，发现稳定敲低ULK1可以明显促进HMEC-1细胞进入S和G2/M期，减少G1期细胞比例，见图2、表1。

3 讨论

CHF是多种心脏疾病发展的终末阶段，心脏重塑无疑对CHF产生了重要影响，而血管内皮细胞正常增殖和保持分泌平衡的功能状态对于维持血管正常功能、防止心血管疾病的发生具有重要作用。血管内皮细胞具有重要的分泌合成和调节血管平滑肌细胞生长的功能，血管内皮细胞可分泌一氧化氮、前列环素以及内皮衍生超极化因子等调控血管平滑肌细胞的增殖，进而调控心脏血管重塑和心肌重塑［7］。

图1 TGF-β在内皮细胞中上调ULK1蛋白表达Fig.1 TGFβ- upregulates ULK1 expression in endothelial cells

图2 ULK1基因敲低促进内皮细胞增殖Fig.2 ULK1 knockdown promotes cell cycle of endothelial cells

表1 各组TGF-β处理后细胞周期百分比比较Tab.1 Comparison of cell cycle percentages in different groups after TGF-β treatment

TGFβ-信号通路是一个包含众多成员的多功能细胞因子大家族，该信号通路主要由各种TGF-β细胞蛋白配体结合细胞外T β R-Ⅱ受体，T β R-Ⅱ结合并激活T β R-I受体进而磷酸化下游的信使蛋白Smad2/3，激活的Smad2/3与Smad4形成复合体，进入细胞核调控目标基因的转录，进而调控炎症反应、细胞增殖、细胞凋亡和组织纤维化等重要的生理病理过程［8-9］。前期研究［10］表明，TGF-β对于促进心肌肥大和心脏纤维化具有重要作用，TGF-β 1过表达转基因小鼠表现出显著的心肌肥大和小肠纤维化表型，而TGF-β 1+/-转基因小鼠可以抵御随年龄带来的心脏纤维化和舒张功能障碍［11］。近期几项研究［12］表明，TGF-β 1配体可以抑制内皮细胞的增殖、迁移和血管生成。TGF-β信号通路抑制细胞增殖的方式是TGF-β能降低Cyclins和CDKs的活性与表达水平，同时也可诱导CKIs的表达来实现细胞周期阻滞［13］，但是在血管内皮细胞中TGF-β是否还具有其他机制调节其增殖还有待进一步研究。

ULK1蛋白最早作为酵母中自噬通路关键蛋白Atg1的同源物被鉴定出来，是一个重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶［14］。ULK1蛋白在哺乳动物细胞自噬过程中发挥关键作用，ULK1与Atg13、FIP200形成蛋白复合物调控自噬体的早期形成，同时ULK1作为蛋白激酶还能磷酸化另一个自噬起始复合物Beclin1-Vps34复合物［15］。最近研究［16］还发现，ULK1有非自噬依赖的功能。ULK1能够磷酸化AMPK β 1亚基108位的丝氨酸，进而调控代谢压力下的细胞周期并且促进细胞存活；更有趣的是，ULK1可直接磷酸化细胞周期伴侣蛋白Cdc37的339位丝氨酸位点，进而调控Cdc37-Hsp90分子伴侣复合体的活性，最终加速细胞周期重要调控蛋白Cdk4、Cdk6、pRb和AuroraB的降解，抑制细胞增殖。ULK1加速Cdk4和Cdk6等蛋白的降解并不是通过自噬过程实现的，敲除Atg3并不能阻止ULK1对Cdk4和Cdk6的降解作用［6］。以上研究表明ULK1可能以非自噬依赖的方式调控细胞周期。

本研究首次在血管内皮细胞中发现TGF-β信号通路可以特异性地上调ULK1蛋白的表达，而上调作用是通过促进ULK1蛋白合成而不是通过抑制其降解实现的；ULK1蛋白在血管内皮细胞中可以有效抑制细胞周期的进展，进而抑制内皮细胞的增殖。对于ULK1在血管内皮细胞中是否也通过磷酸化Cdc37，进而通过影响Cdc37-Hsp90复合物活性调控细胞周期，还需要进一步探讨和研究。本研究表明TGF-β除了调控细胞周期抑制因子之外，还可通过ULK1蛋白激酶影响细胞周期。有研究［6，16］表明，ULK1除了在自噬通路中发挥关键作用，在调控细胞周期方面也发挥着重要作用。由于血管内皮细胞对心肌细胞具有重要的保护机制，开发针对ULK1激酶的小分子抑制剂，对临床治疗CHF有一定的潜在价值。