原生质体紫外诱变选育D—核糖高产菌株的研究

闫世梁　张生克　刘银霞　史小利　肖媛　勾丽莉

摘 要：以枯草芽孢杆菌XB02为出发菌株，采用紫外诱变原生质体的方法，获得了1株D-核糖高产菌株T32，其摇瓶发酵产糖达103.6g/L。遗传性状稳定良好。

关键词：D-核糖；草芽孢杆菌；原生质体；紫外诱变

D-核糖是一种五碳糖，是RNA等的组成糖，在医药中间体、医疗保健、运动营养等领域具有广泛的用途。发酵法是目前最先进的D-核糖生产方法，D-核糖高产菌株的选育一直是国内外从业者关注的问题 [1]。

去除了细胞壁的原生质体经诱变更易发生突变[2]，本实验旨在对D-核糖产生菌进行原生质体诱变，以期获得高产菌株。

1 材料与方法

1.1 菌种

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）转酮醇酶变异株XB02。

1.2 培养基

1.2.1 完全培养基

牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%， 葡萄糖0.1%，NaCl 0.5%， 琼脂2.0%，pH6.7-7.0。

1.2.2 再生培养基

完全培养基加入0.5mol/L的蔗糖和0.02mol/L的MgCl2，pH6.7-7.0。

1.2.3 筛选培养基[3]

完全培养基中加入6.0%的D-核糖，pH6.7-7.0。

1.2.4 发酵培养基

葡萄糖20%、玉米浆3%、（NH4）2SO4 0.6%、CaCO3 3.6%、MnSO4·4H2O 0.005%。pH 6.7-7.0。

1.3 溶液

1.3.1 高渗缓冲液

丁二酸钠42.57g/L，蔗糖170.0g/L，MgCl2 4.06g/L，pH 6.7，115℃灭菌20min

1.3.2 蛋清溶菌酶溶液

高渗溶液配制浓度为1mg/ mL的蛋清溶菌酶液，微孔过滤除菌。

1.4 方法

1.4.1 出发菌株的培养

出发菌株接种于20mL /250mL完全培养基培养基的三角瓶，220r/min，36℃培养。定时测定OD590nm，用对数中后期的菌体进行原生质体制备及诱变。

1.4.2 原生质体制备

取5mL培养液，4500r/min，离心15min，弃上清。用高渗溶液洗涤菌体2次，加入溶菌酶菌悬液5mL，36℃酶解120min。4500r/min离心15min，弃上清。用高渗溶液洗涤菌体2次，配成高渗菌悬液5mL。

1.4.3 原生质体再生

以高渗缓冲液梯度稀释，取0.1mL稀释菌液涂布于再生平板，36℃培养2-3d。

1.4.4 原生质体诱变及筛选

调整原生质体高渗悬液的浓度为108cfu/mL，取10mL于培养皿中，置于磁力搅拌器上，20W紫外灯垂直距离20cm照射。取不同照射时间的处理液，涂布于再生平板上，计算原生质体的死亡率。

再生培养基平板上长出的菌落对应地挑于完全培养基和筛选培养基上，选取在筛选培养基上生长良好的菌落作为初筛菌株。然后进行摇瓶发酵，D-核糖产率较高的即为目的菌株。

1.4.5 遗传稳定性实验

将筛选到的高产菌株连续传种10代，将2、4、6、8、10代菌株接入20mL/250mL发酵培养基中，220r/min，36℃搖瓶发酵至残糖为零，分别测定培养基中D-核糖含量。

1.5 测定方法

①D-核糖含量的测定：

苔黑酚法。

②发酵转化率的计算：

发酵转化率（%） = 发酵液D-核糖量/培养基中葡萄糖量×198/150×100%

2 结果与讨论

2.1 菌龄选择

经测定，10-12h为XB02生长的对数中后期，选择此时进行原生质体的制备及诱变。

2.2 原生质体紫外诱变

死亡率与诱变时间的关系如图1。一般认为死率为70%～80%时诱变效果最好。因此，选择诱变时间为20s，此时的致死率74.9%。

2.3 D-核糖高产菌株的筛选

紫外诱变后从再生培养基上挑菌106株，均可完全培养基上生长，可在筛选培养基上生长的有9株。然后进行摇瓶发酵，选出了3株D-核糖高产菌株，其发酵结果如表1。3株菌的产糖性能均比较稳定，其中T32产糖平均可达103.6g/ L。

2.4 菌株T32的遗传稳定性

菌株T32的遗传稳定性考察结果见图2，经多次传代，菌株T32的产糖能力无明显变化，遗传性状稳定，有望应用于工业生产。

3 结论

对出发菌株XB02进行原生质体制备，并对原生质体进行了紫外诱变，得到了一株D-核糖高产菌株T32，其遗传性状稳定，有望应用于工业生产中。

图2 菌株T32的遗传稳定性

参考文献：

[1]夏海平，吴义明.D-核糖生产菌的选育及发酵工艺的改进[J].氨基酸和生物资源，2006（04）：30-32.

[2]常景玲，张志宏，刘学良.D-核糖生产菌的原生质体诱变及其发酵培养[J].生物技术通讯，2006（02）：195-197.