基于核糖开关的新型基因表达调控系统的应用

熊莹喆 曹苑青 肖玲慧 李招发

（1. 华侨大学分子药物研究院，泉州 362021；2. 华侨大学生物医学学院，泉州 362021）

基于核糖开关的新型基因表达调控系统的应用

熊莹喆 曹苑青 肖玲慧 李招发

（1. 华侨大学分子药物研究院，泉州 362021；2. 华侨大学生物医学学院，泉州 362021）

核糖开关是能对细胞环境的改变做出反应的顺式作用元件，通过改变自身的构象实现对基因表达的调控。基于核糖开关调控方式简洁，无需蛋白质参与，响应迅速，且自身片段小，结构简单，易于设计和改造等特性使其在生物医学领域体现出诸多应用优势。对核糖开关的结构，调节机理以及这种新型基因表达调控系统在基因治疗、抗生素新靶点的开发、病毒疫苗的安全控制、新型核糖选择器和生物体内传感器的应用进行了综述，旨为启示我国核糖开关的新型应用。

核糖开关；基因表达调控系统；机理

核糖开关（riboswitch）是一段长度为34-200 bp的天然核苷酸序列，多存在于mRNA的5'非编码区（5'UTR）或3'非编码区（3'UTR），它是通过特异性结合配体进行基因表达调控的顺式作用元件。2002年，Winkler等［1］发现硫胺素衍生物结合mRNA某结构元件后能直接调节细菌基因表达，同年，Nahvi等［2］也证实了这类mRNA非编码区的某些结构元件具有调控基因表达的能力，之后关于这些RNA结构元件的研究便迅速发展，并将这些RNA结构元件命名为核糖开关。在短短的十几年里，已经在原核细胞和真核细胞中发现不少于20种天然存在的核糖开关，并且它们在与一系列小分子配体结合后能广泛参与基因的转录、转录后的修饰以及翻译等调控作用。

大多数的基因调节机制都涉及到蛋白质的参与，然而核糖开关这种mRNA的调控元件无需蛋白质参与，就能直接与环境中的小分子代谢物、第二信使、tRNA、离子、维生素和氨基酸结合，调控下游的基因表达，且调控基因的能力与蛋白质相比毫不逊色［3］。这种简单且高效的新型基因表达调控系统使核糖开关在生物医学领域展现出特有的优势。本文综合国内外核糖开关的最新研究进展，对核糖开关的结构机理，特别是在生物医学领域的应用进行了介绍，旨为启示开发人工高效的新型核糖开关，开辟其新型应用。

1 核糖开关的结构特点

核糖开关一般由两部分组成：（1）适体结构域（aptamer domain），作为感应器结合特异性的配体；（2）表达平台域（expression platform），位于适体结构域的下游，作为效应器调控基因的表达。两部分由作为传送器的转换序列（switching sequence）连接［4］。适体与配体结合后，适体结构域构象发生改变，这种变化的信号通过转换序列传递给表达平台域，从而进行相应的基因表达调控［5］。核糖开关控制的基因通常参与细胞的关键代谢途径，所以能特异性结合配体的适体结构域序列通常高度进化保守，不容易发生基因突变［6］。

能与核糖开关结合的配体有很多，每一种配体分子需要与之完全匹配的独特的适体结构，另外，属于同一类型的不同细菌中的核糖开关常常可以调节不同基因的表达。因此，核糖开关在二级或三级结构上必然有巨大的差异性。根据结构特征的不同，我们可以将大多数核糖开关分为两类，连接型核糖开关（junctional riboswitch）和假结型核糖开关（pseudoknoted riboseitch）［7］。连接型核糖开关是由连接点与几个径向的螺旋连接在一起的结构，如嘌呤（purine）核糖开关［8］和TPP核糖开关［9］。假结型核糖开关是由RNA茎环结构的环与外侧部分通过碱基对连接的结构，如SAM-Ⅱ核糖开关［10］、氟化物（fluoride）核糖开关［11］以及PreQ1核糖开关［12］。

2 核糖开关的调控机制

2.1 核糖开关的配体

核糖开关结构的多样性使它能识别多种不同结构的配体。最常见的结合配体是辅酶及其衍生物，如焦磷酸硫胺素（TPP）和黄素辅酶黄素单核苷酸（FMN）等［13］，其次是嘌呤及其衍生物，如鸟嘌呤（Gua）［13］和环二鸟苷（c-di-GMP）［14］。另外，氨基酸如赖氨酸（Lys）也可作为结合配体［13］。而最小的配体家族是金属离子配体，如Mg2+，近年来发现Ni2+/Co2+，Mn2+也可以结合核糖开关［15，16］。除此之外，还有一群被称为“孤核糖开关”（orphan riboswitch）［17］的与核糖开关功能极其类似的mRNA元件，目前没有已鉴定的配体，但也有研究表明这种孤核糖开关能感应一些新型的化学物质，如ATP［18］。

2.2 基因表达调控机制

核糖开关基因表达调控系统通常存在3种调节机制：转录终止型、翻译的起始或抑制型以及自身剪切作用型［19］。

转录终止型核糖开关通常在结合配体后会形成一个终止子发夹结构以终止转录的继续［20］，但是当配体浓度降低，无法与核糖开关适体域充分结合时，表达平台域会转换终止子发夹结构成为抗终止子结构，于是转录激活，可以继续转录。另外，部分核糖开关的转录终止也涉及到了Rho因子的参与。Rho因子是存在于原核生物中具有解旋酶活性的转录蛋白，当它结合到RNA转录复合物中随着转录一起移动，识别终止信号后，可使新产生的RNA从RNA-DNA转录复合物中释放出来，从而可以使转录提前终止［21］。FMN核糖开关在大肠杆菌中表达上游ribB基因就是运用这种调节机制进行的［22］。

翻译的起始或抑制型核糖开关中，表达平台域的结构改变与核糖体结合位点（RBS）联系在一起。配体与适体域结合与否，会改变表达平台域的构象，使RBS暴露或屏蔽进而决定翻译的起始或抑制。SAM-Ⅱ核糖开关就是在S-甲硫氨酸（SAM）结合适体结构域后屏蔽RBS，抑制翻译的典型例子［23］。而存在于创伤弧菌mRNA的腺嘌呤核糖开关则是在配体结合后暴露SD序列（原核生物中的RBS序列），开始翻译［24］。

自身剪切作用型核糖开关是基于表达平台域具有核酶活性，在与配体结合后，能催化自我剪切RNA，使RNA降解，断裂或重新拼接。6-磷酸葡糖胺合成酶（GlmS）核糖开关就是具有核酶活性的核糖开关，当与配体6-磷酸葡糖胺（GlcN6P）结合后，GlmS核酶被激活剪切GmlS RNA，使mRNA 5'端三磷酸帽子结构降解，暴露出5'-OH基团，极易被核糖核酸酶（RNase J1）识别并降解GlmS mRNA［25］。

3 核糖开关的应用

3.1 基因治疗的新型调节方式

基因治疗是指通过基因工程的方法将外源基因引入患者的受体细胞，从根本上纠正受体细胞有缺陷的基因，或通过外源基因表达的产物治疗某些疾病，在临床试验中已经取得重大成功［26］。实时调控基因表达水平是基因治疗的关键，外源基因表达过多或过少都不能使治疗达到理想状态。目前常用的是转录因子调节［27］，而转录因子这种蛋白质调控方式需将编码相应转录因子的基因与治疗基因一起转染入细胞，异源蛋白的免疫毒性便是首要考虑问题，其次，调节元件的复杂结构和过大体积，响应调节信号不够灵敏，响应时间长，这些都限制了其临床应用［28］。相比之下，核糖开关这一新型基因表达调控系统具有多种应用优势：第一，核糖开关是一段少于200 bp的核苷酸序列，不需要启动子元件，结构简单，易于改造与设计；第二，核糖开关对基因表达的调控不需要辅助因子，减少了免疫原性；第三，核糖开关的引发配体都是简单的小分子或离子，降低了开发应用成本，如乳糖诱导体系就比IPTG这种诱导剂便宜很多；第四，大多数核糖开关的配体都可以直接穿入细胞壁或细胞膜，使核糖开关对细胞所处环境改变的反应更灵敏，调节效率更高；第五，核糖开关位于mRNA中，是一种顺式作用元件，可使调节更紧密。随着环境中配体浓度的改变，核糖开关可以相应的启动或抑制基因表达，这种新型且简单的调控方式使核糖开关为基因治疗提供了新的研究思路［29］。例如，用核糖开关调节T细胞内白介素-2（IL-2）和白介素-5（IL-5）基因的表达从而控制T细胞增殖的研究［30］。另外，也有研究表明，核糖开关在基因治疗中确实具有良好的效果，已达临床试验阶段［31］，这也使核糖开关在基因治疗的应用方面受到广泛的关注。

3.2 抗生素开发的新靶点

随着日益严重的细菌耐药性问题，寻找可以优化传统抗生素对抗细菌的方法迫在眉睫［32］。由于大多数核糖开关存在于原核生物中，且其调控的基因通常是致病菌生存或致病的关键基因，使得核糖开关可以作为抗生素研究的新靶点［33］。相比于传统的抗生素，核糖开关拥有更低的人体细胞毒性，因为目前还没有在高等哺乳动物细胞内发现核糖开关。其次，核糖开关的配体通常是小型复合物、简单的代谢物和离子等，易于改造和设计，也方便进出细胞应用于基因调控系统，这为开发新型抗生素奠定了基础。另外，核糖开关的适体结构域序列高度进化保守，一种类型的核糖开关可存在于多种细菌中，且单一的突变不会影响抗菌效果，抗菌范围更广阔。因此，核糖开关在抗生素新靶点的开发与应用领域具有良好的前景。目前已发现的可应用于抗生素新靶点的核糖开关分为5种［13］：TPP核糖开关、FMN核糖开关、Lys核糖开关、Gua核糖开关和glmS核酶核糖开关。近年来在抗生素耐药性的细菌病原体中还发现了广泛存在的氨基糖苷类结合核糖开关［34］，为新型抗生素核糖开关靶点提供了又一研究方法。在药物治疗方面，我们还需要寻找更多的配体及其类似物，以及在没有配体存在下用其他化合物诱导核糖开关，为核糖开关这一抗生素新靶点的研究提供了更多的思路。

3.3 病毒疫苗的安全开关

研究发现一些病毒会倾向于感染并杀死肿瘤细胞，于是被称为“溶瘤病毒”（oncolytic viruses），将这种溶瘤病毒注入人体内治疗肿瘤，其安全性和可控性是首要考虑问题，而用于控制病毒以防其在治疗期间产生副作用的抗病毒药物仅在极少数病毒药物中起作用。因此，找到一种能有效控制溶瘤病毒的致病性和其他副作用的安全开关是迫切需要的［35］。核糖开关是一种能被小分子配体诱导的新型基因调控元件，利用基因工程的方法在病毒基因中插入核糖开关，经药物诱导实时控制病毒的复制、侵染及细胞毒性。这种基于核糖开关的基因安全开关能广泛应用于DNA或RNA病毒，使新型活病毒疫苗的安全性进一步提高。在2014年已报道了核糖开关可成功应用于控制人类致病性病毒：腺病毒和麻疹病毒的功能系统［36］。Ketzer等［36］将具有自切割核酶活性的人工适体酶核糖开关插入腺病毒的基因，致使病毒仅在肿瘤细胞中具有复制能力。该核糖开关可以在没有配体结合的情况下启动基因表达，而在加入茶碱配体后，核酶转换为活性构象并开始mRNA的自切割，从而抑制基因表达。研究表明，该核糖开关关闭了腺病毒E1A基因的表达后，可使病毒复制减少约200倍。这项研究同样适用于麻疹病毒，在加入茶碱配体后，麻疹病毒的复制在48 h后减少了50倍。这是核糖开关第一次成功应用于人类致病性病毒的研究。基于核糖开关这种结构简单的RNA固有调控元件，将会是真核基因表达系统中诱导型启动子的第一备选。

3.4 高产代谢物菌株的核糖选择器（riboselectors）

微生物工程是利用微生物生产对人类有用的产品的一类技术，然而大多数目标产物没有典型的特征，不易被常规的筛选工具识别而不能获取［37］。由于核糖开关是对细胞内代谢物的浓度产生快速反应的基因表达调控元件，能特异性感应不易筛选的代谢物，其与目标代谢物结合后，核糖开关适体结构域构象发生改变，然后将信号传递给下游基因，在筛选压力下仅使目的细胞存活，这种基于核糖开关而设计的选择装置称之为“核糖选择器”［38］。目前已成功应用于大肠杆菌中的Lys核糖开关［39］，将Lys核糖开关与TatA基因筛选模型［40］联合应用，当细胞内赖氨酸与Lys核糖开关结合后，可抑制下游筛选基因-tatA基因的表达，使已在细胞质内积累丰富赖氨酸的细胞在Ni2+的存在下可以存活，即在Ni2+的筛选压力下得到赖氨酸含量丰富的细胞。实验表明，在这种筛选系统中，赖氨酸的产率可在4轮筛选之后成功增长75%［39］。综上所述，基于核糖开关这种新型基因表达调控系统的核糖选择器，是筛选高产目的代谢物菌株的有效手段。

3.5 体内传感器

生物传感器可检测多种生命物质或化学物质，识别一种给定物质后通常会引起一系列的电化学反应或光学信号用于进一步的分析。目前常用的是酶生物传感器，但其价格昂贵，分离纯化目标物质操作复杂，研究者们期望能在细胞内找到一种固有且稳定的生物传感器［41］。核糖开关是RNA固有的顺式作用元件，能通过适体结构域的一小段序列识别小分子配体，将信号传递给表达平台域调控下游基因的表达。通常可在体外通过配体指数富集系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）从头合成所需要的适体，然后设计成为核糖开关的适体域，理论上应用SELEX技术能筛选到自然界几乎所有靶分子的适体［42］。例如，用核酶核糖开关作为体内传感器检测酵母细胞内代谢物的含量变化情况，在适体域与黄嘌呤结合后，下游绿色荧光蛋白（GFP）基因能顺利表达，通过检测GFP的变化便可分析黄嘌呤的含量变化［43］。这种人工设计的核糖开关与天然核糖开关相似，并能与低浓度配体结合，响应更灵敏，在生物传感器领域拥有广阔的应用前景。

4 展望

从核糖开关的发现至今的十几年时间里，核糖开关这种新型基因表达调控系统在多个生物医学领域中展现出无可比拟的应用优势。为了设计出更理想的人工核糖开关，我们需要注意几个方面：（1）目前高等哺乳动物体内没有发现核糖开关，可能是核糖开关存在潜在的免疫反应，前不久就有报道称核糖开关可以激活人体固有免疫因子PKR［44］；（2）人工设计的配体可能不容易进入宿主细胞固有代谢物的代谢途径；（3）部分天然存在的核糖开关可能在一定的背景条件下才会发挥作用，如温度和pH等。同时，我们还需要进一步探索和认识核糖开关结构和功能的关系，以及核糖开关识别配体的机制，为设计新型核糖开关，寻找靶向配体奠定基础。本文所涉及的核糖开关的应用只是核糖开关广泛应用前景中的冰山一角，更多的新型核糖开关及其应用还有待开发，在未来的生物医学、药物治疗等领域，核糖开关这种天然RNA调控元件及其新型基因表达调控系统必将发挥巨大作用。

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（责任编辑 狄艳红）

Applications of Riboswitch-based Novel Regulation System of Gene Expression

XIONG Ying-zhe CAO Yuan-qin XIAO Ling-hui LI Zhao-fa
（1. Institution of Molecular Medicine，Huaqiao University，Quanzhou 362021；2. School of Biomedical Science，Huaqiao University，Quanzhou 362021）

Riboswitches are cis-acting elements that can respond to the environmental changes of the cell by altering its conformation to achieve the regulation of gene expression. Due to its characteristics of simple regulation system without proteins involved，response fast，short sequences with simple structure，and easy to design and modify，applying it in biomedical area should be in superiority. The review addresses the advance of the structure and regulation mechanism of riboswitches，as well as the applications of this novel regulation system of gene expression in gene therapy，the development of novel target for antibiotic，the safety switch for virus vaccine，and the new riboselectors and biosensors，aiming at inspiring the application of riboswitches in China.

riboswitch；regulation system of gene expression；mechanism

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.006

2016-04-29

福建省引导性项目（2016Y0063），福建省自然科学基金资助项目（2013J01381），中央高校基本科研业务费资助项目（JB-ZR1142）

熊莹喆，女，硕士，研究方向：病毒检测；E-mail：xiongyingzhe@hqu.edu.cn

李招发，男，博士，副教授，研究方向：基因工程，生物药物；E-mail：lizhaofa@hqu.edu.cn