高通量测序技术在胚胎植入前遗传学检查中的应用

周飞飞，谭季春 ，徐小延，孔 琳，梁晓茵，董 萌，李萍萍

胚胎植入前遗传学检查(PGT)是通过对配子或胚胎的遗传分析，选择未见异常的胚胎植入子宫，包括胚胎植入前遗传学诊断（PGD）和胚胎植入前遗传学筛查(PGS)。PGD主要适用于染色体遗传病筛查，在阻断致病基因纵向传递的基础上，避免遗传病胎儿的出生[1]；PGS主要适用于染色体非整倍体的筛查，以提高着床率和活产率[2]。

高通量测序又名下一代测序和深度测序，以能一次对成千上万的DNA分子进行序列测定为标志，具有速度快、通量大、结果一致性好、简便高效等特点[3]。可对胚胎全基因组进行检测，仅需低深度、高通量测序，就能完成突变位点和胚胎染色体的检查，并能发现新的突变位点，保证低成本、快速完成胚胎的遗传诊断，从而挑选无异常的胚胎植入子宫。笔者主要介绍开展高通量测序技术在胚胎植入前遗传学检查中的应用情况。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2016年1月～2017年9月来医院辅助生殖中心就诊的患者，在自愿的原则下，纳入符合PGS/PGD适应证的夫妇，均签署知情同意书，并通过医院伦理委员会的认可。PGS指征：自然流产≥3次或2次自然流产且至少其中一次流产组织基因检测异常、反复种植失败（移植优质胚胎次数≥3，或移植≥10个可移植胚胎）、高龄（＞38岁）等；PGD指征：单基因病、染色体病、HLA配型、线粒体病等。

1.2 方法

1.2.1 常规促排卵 筛选符合PGD/PGS适应证的夫妇进行试管婴儿术前相关检查，相关化验检查合格后，进行试管婴儿促排流程，促排方案包括：长方案、短方案、拮抗剂方案等，由临床医生根据患者自身情况选择适合患者本人的方案。促排过程中，通过超声及激素水平检查评估卵泡发育情况，根据卵泡数量、大小和激素水平决定扳机日及用药和药量，并于扳机药物注射36～38 h后取卵。

1.2.2 胚胎检查 为了避免胚胎活检取材时透明带上多精子因素的干扰，在受精方式上采用卵胞浆内单精子显微注射技术。卵裂期胚胎评分以Istanbul共识为标准[4]，囊胚期胚胎评分按照Gardner评分标准[5]。受精后的胚胎培养到第5～6 d时，选择发育3期以上的囊胚进行活检；对4期的胚胎需对远离滋养层一侧的透明带进行激光打孔，待滋养层细胞孵出，用活检针取3～5个滋养层细胞进行囊胚活检。活检细胞在无钙的磷酸盐缓冲液吹吸后，装入0.2 ml的无菌eppendorf管中，应用高通量测序技术进行基因筛查（测序仪：IonProton，DA8600），挑选生物信息分析无异常的胚胎行解冻移植。对于成功妊娠者，须在孕16～20 w时行羊水穿刺检查，确保100%随访。

1.3 随访 生殖中心专职人员通过电话方式对患者进行随访，包括妊娠结果、羊水穿刺结果及整个孕期是否顺利和胎儿出生情况等。

2 结果

共对251例的囊胚进行了全基因组检测，有155例可行胚胎移植。目前已有119例行解冻移植，妊娠率 71.4%（85/119），分娩率 35.3%（30/85），流产率 3.5%（3/85），引产率 1.2%（1/85），其余继续妊娠中。见表1。

活检胚胎1000例，胚胎检出率92.5%，染色体平衡易位者122例；染色体罗伯逊易位者43例，染色体倒位者11例，单基因病者12例；Y染色体微缺失7例以及反复流产等共计251例，其中染色体异常占较大比例。见表2。

表1 行高通量测序的PGD/PGS患者的基本信息

3 讨论

虽然本研究样本量有限，但仍可以从表1、2中了解到，在PGS/PGD中应用高通量测序技术可降低流产率，提高妊娠率，也有效避免了基因病患者致病基因的纵向传递。共活检了1000个胚胎，有检测结果的胚胎数为925，检出率为92.5%。未检出的胚胎可能是由于活检胚胎质量差，或是样本转移异常，或是受当前检测技术水平影响等。共有119例行解冻移植，妊娠数85，妊娠率为71.4%，流产率为3.5%，大大增加了患者的妊娠率，降低了流产率。

随着科学技术的不断发展，高通量测序技术越来越成熟，凭借其速度快、准确率高、通量高等优势，已经渗透到生命科学的多个领域[6]，如在病原微生物鉴定、肿瘤基因组序列测定以及临床遗传疾病的无创产前诊断和筛查等方面。但由于其测序成本较高，还不能常规应用到临床中，而且由于其测序通量大，对于后期测序数据，较难分析。

表2 PGD/PGS患者遗传学检查基本信息及高通量测序结果

在对患者进行随访时，有1例因男方罗氏易位来医院就诊要求行PGD助孕的患者，在妊娠13 w时行颈后透明带扫描（NT）发现异常，引产后行组织检测发现胎儿患有Turner综合征。PGS/PGD的取材经历了从卵母细胞极体到卵裂球到囊胚滋养层细胞的发展过程，通过极体活检仅能提供母源的遗传信息，有其局限性；卵裂球活检仅能提供1～2个卵裂球，且嵌合概率大，影响对胚胎的真实判断。因此，现在几乎均为囊胚滋养层活检。在胚胎发育过程中，内细胞团发育为胎儿，滋养层细胞发育为胎盘部分，活检不影响胎儿发育，所以此取材部位越来越受推崇。但毕竟胎盘部位的基因结果并不能完全代表胎儿整体，且由以上可知测序技术本身有其局限性。同时也应该充分认识到，PGD/PGS还不是一种很完善的遗传学检测技术，其安全性问题有待进一步研究。此外，对于行PGS/PGD技术的子代安全性问题，还需要大样本的追踪随访。

综上所述，应用高通量测序技术行胚胎植入前遗传学检查，可降低反复流产率及患病胎儿的出生率，提高临床妊娠率。