雷帕霉素衍生物对胰岛的毒性研究

张娟 ，付嘉钊 ，王路敏 李艳萍 江红 ，夏俊杰 齐忠权 （1.厦门大学器官移植研究所，福建 厦门 110；.福建省器官与再生重点实验室，福建 厦门 110；.上海市同济医院，上海 000；.上海长海医院，上海 00；.福建省微生物研究所，福建 福州 0000；.广西大学医学院，广西壮族自治区 南宁 000）

免疫抑制剂的开发与运用一直推动着器官移植领域的发展［1］。自Edmonton方案被提出以后，移植领域发生了质的飞跃［2］，尤其是雷帕霉素与他克莫司的开发与利用，使得该方案得到广泛的认可与临床运用。近年来，雷帕霉素广泛应用于器官移植术后排斥反应治疗中，包括抑制皮肤、心脏、肾脏、肝脏等器官移植后的排斥反应［3-5］。随着研究的不断深入，研究者们发现免疫抑制剂在延长移植物存活时间的同时［6-7］，也给胰岛本身带来了严重的毒性作用，包括抑制胰岛细胞增殖、促进胰岛细胞调亡、抑制胰岛细胞分泌胰岛素等［8-16］。依维莫司作为抗肿瘤药物应用于临床时也会诱发高血糖的现象［17-20］。因此，如何避免免疫抑制剂对胰岛的毒副作用从而延长胰岛移植物的存活，是胰岛移植面临的一大难题。雷帕霉素是胰岛移植应用中最常用的免疫抑制剂之一，但是系列研究表明它对胰岛本身存在一定毒性作用，所以新型免疫抑制剂的开发迫在眉睫。

依维莫司、地磷莫司、佐他莫司是雷帕霉素的衍生物，随着雷帕霉素对肿瘤及移植的作用不断被开发和深入探讨，这几种衍生物的开发也相继问世。其中依维莫司在临床器官移植中较多见，已经应用于肾［21］、心［22］、肝［23］、肺［24］及胰岛移植［25-26］，但是地磷莫司、佐他莫司、替西罗莫司在移植领域研究甚少，尤其是对胰岛的研究。本文首次详细阐述并对比3种雷帕霉素衍生物（依维莫司、地磷莫司、佐他莫司）对胰岛的毒性作用。通过体外实验来研究雷帕霉素的3种衍生物对胰岛是否具有毒性。进一步探讨雷帕霉素衍生物是否能避免胰岛毒性而更能优于雷帕霉素在移植领域得到广泛的应用。

1 材料与方法

1.1 实验细胞：小鼠胰岛素瘤细胞（MIN6细胞）培养在DMEM高糖培养基，含10%胎牛血清、0.01%β-巯基乙醇和1%青链霉素。

1.2 主要试剂：雷帕霉素（LClabs）、依维莫司、地磷莫司、佐他莫司（福建微生物研究所馈赠），环孢素A（Selleck），三氧化二砷（北京双鹭），细胞增殖检测试剂盒（Roche），Annexin V调亡检测试剂盒（BD PharMingen），碘化丙啶（propidiμm iodide，PI）（Sigma），Rnase酶（天根生化科技有限公司），细胞增殖及毒性检测试剂盒（CCK8，全式金），小鼠胰岛素检测试剂盒（Millipore）。

1.3 免疫抑制剂的配制：雷帕霉素配制需称取1 mg雷帕霉素，用99.9%无水乙醇配制成浓度为1 mg/ml的储存液，0.22 μm的过滤器过滤，保存于-80℃冰箱，再用DMEM培养基稀释成工作液浓度，保存于-20℃冰箱备用。依维莫司、地磷莫斯、佐他莫司、环孢素A配制同前。

1.4 免疫抑制剂的浓度：雷帕霉素及其衍生物设100 μg/L为研究浓度，环孢素A浓度为10 mg/L作为阳性对照。

1.5 检测细胞的增殖能力：MIN6细胞接种至96孔平底培养板内，待细胞贴壁后，饥饿24小时；之后分组刺激细胞，按照雷帕霉素、衍生物以及环孢素A的浓度，各组设置3个副孔，培养48小时。按5-溴脱氧尿嘧啶核苷法（5-bromo-2-deoxyuridine， BrdU）提供的说明书进行实验操作。

1.6 检测细胞活力：细胞准备同前。检测前加入10% CCK8（即每孔加入 10 μl CCK8，90 μl完全培养基），继续放入5% CO2培养箱续培养1 ～ 4小时，注意观察培养基的颜色，若各组间颜色差异明显则可准备上机检测。在450 nm波长处测定吸光度（A）值。

1.7 PI检测细胞周期：准备细胞后，雷帕霉素及其衍生物（100 μg/L）刺激细胞48小时，PI染色，过滤，上机检测（Partec流式细胞仪）。

1.8 Annexin V/PI双染法检测MIN6细胞的调亡：雷帕霉素及其衍生物（100 μg/L）和三氧化二砷（5 μmol/L）刺激细胞48小时 ；按照BD FITC Annexin V细胞调亡试剂和提供的说明书进行实验操作。

1.9 检测细胞分泌胰岛素功能：准备细胞。加药处理培养48小时，磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS） 清洗细胞，KRBH液平衡30分钟，再换用含葡萄糖浓度为2.8 mmol/L 和16.7 mmol/L的KRBH液500 μl，37℃孵育1小时，分别作为基础胰岛素分泌（basic insulin secretion，BIS）和糖刺激的胰岛素分泌（glucose stimulated insulin secretion，GSIS），收集上清液。后续根据Millipore试剂盒的步骤进行。

1.10 统计学分析：体内试验各组间数据比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），多重检验采用Bonferroni校正。各组间数据比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。所有统计学分析均出自GraphPad Prism®5软件计算结果。

2 结 果

2.1 雷帕霉素衍生物抑制MIN6细胞增殖（图1）：我们用100 μg/L的药物浓度处理细胞48小时，与阴性对照（无水乙醇）相比，发现依维莫司、地磷莫司、佐他莫司和雷帕霉素一样，都会抑制细胞增殖，差异具有统计学意义。

图1 雷帕霉素及衍生物对MIN6细胞增殖的影响

2.2 雷帕霉素衍生物抑制MIN6细胞活力（图2）：结果发现，与阴性对照（无水乙醇）相比，3种衍生物与雷帕霉素均能抑制细胞活力，差异具有统计学意义。

2.3 雷帕霉素衍生物在MIN6细胞周期中的研究（图3）：结果发现，衍生物与溶剂无水乙醇相比，都有增加G1期的比例和减少S期比例的趋势，但差异并无统计学意义。这种趋势也与上述增殖实验和细胞活力实验中的结果得到相互印证。雷帕霉素及其衍生物也许通过抑制细胞周期，抑制了MIN6细胞的增殖。

图2 雷帕霉素及衍生物对MIN6细胞活力的影响

图3 雷帕霉素及衍生物对MIN6细胞周期的影响

2.4 雷帕霉素衍生物对MIN6细胞调亡的影响（图4）：三氧化二砷作为阳性对照（本实验室通过前期研究发现三氧化二砷能明显促进细胞调亡，因此我们选择三氧化二砷作为阳性对照，其浓度为5 μm/L）。通过上述实验，我们发现3种衍生物均抑制细胞的增殖和活力，作为阳性对照的三氧化二砷明显诱导了细胞调亡，而雷帕霉素及其衍生物也不同程度地诱导了MIN6细胞的调亡，虽然调亡细胞比例稍大于无水乙醇作用下MIN6细胞调亡的比例，但无统计学意义。雷帕霉素、依维莫司、地磷莫司、佐他莫司4种药之间相比，对MIN6细胞调亡的诱导也无明显差异。实验结果显示，雷帕霉素及其衍生物也许并非通过诱导MIN6细胞调亡来抑制其增殖和细胞活力。

图4 雷帕霉素及衍生物对MIN6细胞调亡的影响

2.5 雷帕霉素衍生物抑制MIN6细胞分泌胰岛素（图5）：雷帕霉素对胰岛的毒性主要是抑制胰岛细胞分泌胰岛素，所以接下来我们研究3种雷帕霉素衍生物对胰岛素分泌功能的影响。实验中，我们分别加入低浓度和高浓度的葡萄糖来刺激细胞分泌胰岛素，得到结果显示雷帕霉素及3种衍生物与阴性对照组相比，明显抑制MIN6细胞分泌胰岛素的功能。

图5 雷帕霉素及其衍生物抑制MIN6细胞分泌胰岛素

3 讨 论

随着Edmonton方案的问世，胰岛移植获得了巨大的进步，雷帕霉素也被越来越多的运用及研究。免疫抑制剂的广泛开发及应用也给移植领域带了新的生机与希望［27］。但免疫抑制剂本身在发挥抑制免疫的优势时，同时也带来了诸多不良反应。雷帕霉素在发挥其免疫抑制作用来延长胰岛移植物生存期的同时，也加重了其对胰岛的损伤。

雷帕霉素对胰岛的毒性主要体现在影响细胞增殖、活力、调亡以及分泌胰岛功能等方面,而依维莫司、地磷莫司、佐他莫司是雷帕霉素的最常见的3种衍生物，这3种衍生物对胰岛是否具有毒性作用，至今鲜有研究。所以我们研究了3种雷帕霉素衍生物对MIN6细胞的增殖、细胞活力、细胞周期、调亡以及分泌胰岛素功能的影响。在实验中发现3种雷帕霉素衍生物与雷帕霉素一样，均能抑制细胞增殖及细胞活力，同时，我们发现它们也能明显抑制细胞分泌胰岛素的功能，但是对细胞周期及调亡并无明显意义。我们分析了药物影响细胞增殖的原因，认为3种衍生物的细胞周期和调亡或许并不是直接导致细胞增殖受到抑制的主要原因。

依维莫司、地磷莫司、佐他莫司这3种衍生物均对胰岛具有毒性。雷帕霉素衍生物对胰岛产生毒性的作用机制和它们是否可以替代雷帕霉素在Edmonton方案中的角色有待进一步研究。