TIPE2在T细胞介导的心脏移植急性排斥反应中的潜在作用

赵越 ，徐双悦韩蔚民庄国洪齐忠权 （.厦门大学器官移植研究所，福建省器官与再生重点实验室，福建 厦门 6005；.厦门大学附属中山医院肝胆外科，慢性肝病肝癌重点实验室，福建 厦门 6005；.广西大学医学院，广西壮族自治区 南宁 50004）

器官移植被认为是治疗器官衰竭的最有效手段［1-3］，然而，移植后的免疫排斥反应一直是影响移植物生存的主要障碍［4-5］。目前，通过抑制急性排斥反应，能够较好地延长移植物的生存期。T细胞介导的免疫反应在急性免疫排斥反应中起到了重要的作用［6-7］。因此，深入研究免疫排斥反应的分子机制，有利于临床寻找新的靶点治疗，缓解T细胞介导的急性免疫排斥反应，从而延长移植物的生存期。

肿瘤坏死因子-α-诱导蛋白8样因子-2（tumor necrosis factor-α-induced Protein-8-like-2，TN-FαIP8L2/TIPE2）是肿瘤坏死因子-α-诱导蛋白8家族成员之一，作为免疫负调控分子，它在固有免疫以及细胞免疫中发挥着重要作用［8］。TIPE2主要在免疫系统中高表达，具有维持免疫平衡和防止免疫过反应的作用。已有文献报道显示，TIPE2主要在淋巴组织中高表达，但是在内分泌组织和骨骼肌中也可以检测到TIPE2的表达［9］，而在众多的肿瘤细胞系中TIPE2不表达或是表达量低。近几年，越来越多文献报道TIPE2与肿瘤的增殖、转移等相关［10-12］。

在系统性红斑狼疮的患者中，TIPE2在外周血单个核细胞中表达量明显下降，说明TIPE2在系统性红斑狼疮的发病机制中至关重要［13］。在移植方面，有文献表明相对于正常肾组织，慢性排斥组的肾移植物TIPE2表达量明显下降，急性排斥反应组TIPE2表达量轻微下降［14］。但在心脏移植中TIPE2的表达情况以及作用尚不清楚。本研究发现，同种异体心脏移植物中TIPE2表达量上升，这与浸润心脏内的T细胞有关，提示了TIPE2与T细胞介导的急性免疫排斥反应可能具有一定的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料：8 ～ 12周雌性C57BL/6以及BALB/c小鼠（上海Slac实验动物有限公司）；流式抗体FITC-anti-CD4、PE-anti-CD8（美国Biolegend公司）；免疫荧光抗体anti-CD4、anti-CD8、anti-TIPE2（加拿大Invitrogen公司）；FITC和PE标记的抗兔抗体（加拿大Invitrogen公司）；实时定量PCR反转录试剂盒、聚合酶链反应扩增试剂盒及TRIzol（日本Takara公司）；全部引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 小鼠心脏移植：我们实施的是血管异位心脏移植术，将供体心脏的主动脉及肺动脉与受体的颈总动脉及颈外静脉采取套管法连接［15］。实验分为两组（同种同系组和同种异系组），同种同系组（n＝3）：将C57BL/6小鼠的心脏异位移植到另一只C57BL/6小鼠颈部；同种异系组（n＝3）：将BALB/c小鼠的心脏异位移植到C57BL/6小鼠颈部。

1.2.2 流式细胞术检测心脏移植物中CD4+与CD8+T细胞：同种同系组及同种异系组小鼠心脏移植物在第7天取出，研磨匀浆后过滤，标记FITC-anti-CD4、PE-anti-CD8抗体，标记好后用来自德国Partec 公司的FACScan仪器进行检测，所获得数据通过FlowJo软件进行处理。

1.2.3 心脏移植物切片及HE染色：第7天时取出受体小鼠的心脏移植物，浸泡在10%福尔马林中，石蜡包裹后切成5 μm的切片，最后用HE染色制片。

1.2.4 免疫荧光：同种异系组小鼠脾脏在移植后7天取出，研磨提取脾细胞后涂片，用4%多聚甲醛泡15分钟，PBS洗涤液洗两次，然后用0.2%Triton X-100冲洗5分钟。5%脱脂牛奶阻断30分钟，然后用CD4、CD8及TIPE2多克隆抗体4℃孵育过夜，过夜后切片用FITC和PE标记的抗兔抗体37℃黑暗孵育1小时。然后，（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色。最后，通过共聚焦激光扫描显微镜观察。

1.2.5 Real-time PCR检测TIPE2、白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2）和γ-干扰素（interferon-γ，INF-γ）的表达：引物序列设计：TIPE2上游引物为5'- CACCCAAGTCACATGACCGC-3'，下游引物为 5'- GAGCCCATCACAGATCTTGC- 3'， IL-2 上游引物为 5'- GGAGCAGCTGTTGATGGACCTAC -3'，下游引物为5'- AATCCAGAACATGCCGCAGAG- 3'，INF-γ上游引物为5'- CGGCACAGTCATTG AAAGCCTA-3'，下游引物为5'- CGGCACAGTCA TTGAAAGCCTA-3'。以β- actin为内参对照，上游引物 为 5'- CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3'，下游引物为5'-ATGGAGCCACCGATCCACA-3'。研磨心脏组织匀浆后，按TRIzol说明书提取总RNA，测纯度和浓度，按照Takara反转录试剂盒合成cDNA，然后按SYBR Green说明书进行实时PCR反应。检测结果由SDS软件进行分析。

2 结 果

2.1 第7天心脏移植物破坏程度及T细胞浸润情况（图1）：第7天时，收取同种同系组和同种异系组小鼠的移植心脏，行切片及HE染色，镜下发现第7天时同种同系组的移植心脏组织肌纤维没有受到破坏，没有明显炎症细胞浸润。而在同种异系组小鼠的移植心脏中，我们可以看到明显的心肌组织受损和炎症细胞浸润。同时，充分研磨心脏组织匀浆后，进行流式细胞仪检测发现，作为介导急性炎症排斥反应的重要免疫细胞T细胞，在小鼠的移植心脏中，CD4+和CD8+T细胞表达均增多（图2）。

图1 心脏移植物HE染色结果

2.2 TIPE2在心脏移植物及T细胞中的表达情况（图3）：从第7天的小鼠心脏移植物中提取RNA，逆转录后Real-time PCR检测发现，相对于同种同系组，同种异系组小鼠的心脏TIPE2表达量出现了明显的上调，因为TIPE2主要在免疫细胞中表达，而T细胞又是介导急性排斥反应的主要细胞，因此，我们推测心脏移植物中的TIPE2可能主要来自T细胞。我们取第7天移植小鼠脾脏提取脾细胞，利用免疫荧光技术定位CD4+/CD8+和TIPE2的关系，发现在CD4+或CD8+的T细胞中，同样高表达TIPE2，这解释了心脏移植物中TIPE2的升高可能来自浸润的T细胞。

图2 心脏移植物流式检测CD4+及CD8+T细胞

2.3 心脏移植物中细胞因子明显上调（图4）：TIPE2作为免疫负调控因子，对于免疫细胞细胞因子的表达与分泌有着直接的影响。通过Real-time PCR检测发现，由T细胞介导分泌的细胞因子IL-2和IFN-γ均在小鼠移植心脏中出现明显的上调，提示了T细胞中TIPE2的表达可能与T细胞细胞因子的分泌具有一定的关系，从而介导了急性排斥反应过程的发生。

图3 a为Real-time PCR检测同种同系组，同种异系组小鼠第7天心脏移植物TIPE2表达水平；b为脾细胞免疫荧光染色CD4+、CD8+及TIPE2；与同种异系组相比，cP＜0.001

图4 a、b为Rea-ltime PCR检测同种同系组、同种异系组小鼠第7天心脏移植物IL-2和IFN-γ表达水平，与同种异系组相比，cP＜0.01，dP＜0.05

3 讨 论

作为肿瘤坏死因子-α-诱导蛋白8家族的一员，TIPE2主要在造血以及淋巴组织中高表达，在稳定免疫平衡中发挥着至关重要的作用［16-17］。在心脏移植排斥反应过程中，正是由于免疫平衡被打破，T细胞识别受体心脏抗原并产生免疫应答，从而导致移植物的失活［18］。我们前期通过一些研究发现，T细胞介导的急性免疫排斥与TIPE2之间可能存在一定的相关性，但其具体分子机制仍不明确。

我们发现在小鼠心脏移植第7天，同种异系组的心脏移植物TIPE2表达量明显高于同种同系组，而TIPE2表达量的提升正是由于介导急性免疫排斥反应的T细胞浸润心脏组织而导致的。在心脏移植物中，浸润的CD4+及CD8+T细胞可分泌众多细胞因子，例如IL-2和IFN-γ等，导致排斥反应的级联扩大，最终导致心脏移植物的失活［19-20］。Huang等［21］报道当T细胞中的TIPE2下调以后，能明显促进IL-2和IFN-γ的分泌。本研究发现在小鼠心脏移植第7天，心脏移植物中的细胞因子IL-2和IFN-γ表达量明显增高，所以我们推测，TIPE2能通过调节T细胞在心脏移植物中细胞因子的分泌，从而影响急性免疫排斥的过程。

本实验中，心脏移植物中的T细胞表达TIPE2，是心脏移植物TIPE2表达增高的主要原因，也提示了TIPE2与T细胞介导的急性排斥反应间的关系，能够为以后临床治疗提供治疗靶点，然而尚需进一步研究TIPE2与T细胞介导的急性排斥反应间的分子机制。