山东地区10株H9N2亚型禽流感病毒HA和NA基因的遗传演化分析

王友令，袁小远，孟 凯，张玉霞，徐怀英，李 莉，亓丽红，宋敏训，艾 武

（山东省农业科学院家禽研究所，济南 250100）

禽流感是由A型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）引发的具有高度接触传染性的病毒病。众所周知，可以导致养禽业的巨大经济损失，同时还严重影响人类公共卫生安全，其危害性不容小视[1]。禽类感染AIV后，症状可表现为呼吸道感染、蛋鸡产蛋量下降明显，最后部分病禽表现为急性全身致死性感染死亡[2]。H9亚型AIV的死亡率低，但可造成免疫抑制和产蛋量下降，引起养禽业巨大的经济损失。

H9N2亚型AIV目前已呈世界性分布，根据分布不同可分为北美和欧亚两个种系[3]。我国于1994年首次公开报道该病的出现[4]。AIV的HA蛋白是A型流感病毒致病性的主要影响因子[5,6]；NA蛋白则能识别受体唾液酸残基并介导病毒进入细胞[7]。为了解 2016年山东地区 H9N2 亚型AIV的HA和NA 基因的变异和重组情况，我们选取分离的10株代表性分离株，对其HA和NA基因进行测序，分析其关键位点是否发生变化，探讨基因遗传演化规律，为山东地区H9N2 AIV的防控提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 毒株 10株 H9N2亚型AIV流行株由山东省农业科学院家禽研究所分离鉴定保存，方法参照文献[1]。10株毒株依次为A/CK/SD/XT31/2016/H9N2、A/CK/SD/XT33/2016/H9N2、A/CK/SD/XT34/2016/H9N2、A/CK/SD/XT35/2016/H9N2、A/CK/SD/XT39/2016/H9N2、A/CK/SD/XT43/2016/H9N2、A/CK/SD/XT44/2016/H9N2、A/CK/SD/XT46/2016/H9N2、A/CK/SD/MHS3/2016/H9N2、A/CK/SD/MHS5/2016/H9N2。

1.2 鸡胚试剂 SPF鸡（胚）由山东省农业科学院家禽研究所SPF鸡研究中心提供。分子生物学试剂均购自大连宝生物有限公司。

1.3 引物合成 利用Oligo6.0软件设计了2对引物，由华大基因公司合成，用于扩增HA、NA基因全长序列，预期扩增的HA、NA基因大小为1687 bp、1402 bp。

表1 扩增所用引物Table 1 The primers for amplification

1.4 病毒RNA的提取及RT-PCR扩增、序列测定 按照Trizol试剂盒说明书提取病毒RNA，RT-PCR扩增、PCR产物连接克隆、序列测定按照文献[7]进行。

1.5 遗传进化分析 10株分离毒株和GenBank上已发表的8株H9N2 AIV的HA、NA基因序列（毒株具体信息及登录号详见表2），用MEGA5.0 分别进行遗传演化分析，绘制系统进化发育树。

表2 参考毒株的基本信息Table 2 The information of H9N2 AIV strains

2 结果

2.1 HA基因的分子特征、同源性和遗传分析 10株H9N2分离株与参考毒株的HA氨基酸序列进行遗传演化分析，绘制的进化树见图1。从进化树可以看出，所有毒株分属为3大分支：BJ94、Y439、G1。10株分离的AIV遗传距离很近，都属于BJ94大分支的G57小分支。10个分离株与BJ94参考毒株HA核苷酸同源性为89.1%～91.3%，氨基酸同源性为90.0%～93.4%；而10株分离株间的HA核苷酸同源性为94.1%～99.8%，氨基酸序列同源性为94.3%～100%。

图1 HN基因遗传进化树Fig.1 Phylogenetic tree of HA genes of isolated AIVs

所有分离株的HA裂解位点均为RSSR↓GLF，为弱毒株的序列特征。同时，分离毒株有6～8个潜在的糖基化位点，其中XT39毒株在218～220位和313～315位出现糖基化位点双缺失。10株分离株191位的构成HA唾液酸受体结合位点的氨基酸为N（天冬酰胺），与经典的禽流感国内分离株的特征一致，非常保守。10株分离株中有3株在198位上变异为A（丙氨酸），6株变异为T（苏氨酸），1株变异为M（甲硫氨酸）。10株分离毒在234位受体结合位点均为L（亮氨酸），也就是具有了与哺乳动物唾液酸α,2-6受体结合的特征。从进化树分析可知，10个分离株同属于欧亚分支中的A/Chicken/Beijing/1/1994亚群，与近年在中国的鸡群中流行的由A/Chicken/Zhejiang/HJ/2007为代表的新的基因型（G57分支）遗传关系最近[8]，推测是由其进化演变而来。

2.2 NA 基因同源性和遗传分析 NA氨基酸序列进化树如图2。从进化树可以看出，所有毒株分属为3大分支：Y280、Y439、G1。10株分离毒株遗传距离很近，都属于Y280大分支的G57小分支。2007 年以来的 H9N2 毒株的NA 基因有相近的同源性关系。10个分离株与近年在中国的鸡群中流行的G57分支遗传关系最近。

所有分离株之间NA核苷酸序列同源性为94.9%～100%，氨基酸的同源性为94.2%～100%；此外，10个分离株与G57分支的NA核苷酸同源性为93.4%～94.4%，氨基酸的同源性为92.7%～94.4%。

分析特殊位点可知，分离的AIV的 NA茎部有不同长度氨基酸的缺失，即颈部均有9个核苷酸（3个氨基酸）的缺失。此外，血凝素结合HB位点第367均为赖氨酸（K）；而368 位，1株为天冬氨酸（D），其余均为天冬酰胺（N）；369位均为甘氨酸（G）。

3 讨论

AIV的HA 蛋白是病原致病性和毒力的主要影响因子，尤其是HA裂解位点氨基酸序列是毒力的决定要素之一。本研究中10个毒株HA基因裂解位点氨基酸序列为RSSR↓GLF，也就是非多个连续碱性氨基酸，因此具有低致病性病毒分子特征。已发现流感病毒表面血凝素 HA蛋白上第226 位氨基酸是关键的受体结合位点，与病毒的受体结合特性和宿主特性相关[8]。本研究中10个毒株的HA受体结合位点只有第149、198、234位氨基酸存在变异。10株分离株中有3株在198位上变异为A（丙氨酸），6株变异为T（苏氨酸），1株变异为M（甲硫氨酸）3种形式。另外有9株病毒在313位氨基酸处出现了一个新的潜在的糖基化位点，这一新糖基化位点出现是否参与病毒的感染尚未知。

NA 能识别受体唾液酸残基并介导病毒进入细胞，NA存在6个潜在的糖基化位点[9]。近年来，国内陆续分离到NA上糖基化位点缺失或突变的毒株，但是氨基酸缺失或突变是否影响NA功能未知。

Sun等[10]发现，同一时期不同地区H9N2病毒株之间同源性较高；不同的是，较早期病毒均有不同程度的变异和进化。杨婧等[11]发现，H9N2 HA和NA基因的变异情况与地域无相关性，但是与时间有部分的相关性。本研究中，从进化树分析可知，10株H9N2分离毒 HA 和 NA 基因呈现出相近的同源性关系。

图2 分离毒株的NA氨基酸进化树Fig.2 Phylogenetic tree of NA of isolated AIVs

H9N2 AIV对公共安全也有潜在威胁。2003年香港出现的感染人类的H9N2禽流感毒株HA蛋白的226位为L，而从家禽体内分离的毒株为谷氨酸（Q）[12]。本研究10株 H9N2 AIV HA蛋白的226 位为L，呈现出典型的人流感受体结合特性。因此，我们需要加强重视低致病性AIV的潜在风险，避免其产生严重的公共危害。