利用基因工程开发更好的真菌源生物农药

筱 禾 编译

(上海市农药研究所，上海 200032)

作为农业害虫和人类疾病媒介的昆虫可引起严重的经济损失，而且每年造成100～300万人死亡。真菌是自然界最常见的昆虫病原菌，已知有 1 000多种。由于真菌的主要生活方式之一——昆虫致病性尚有很大部分未经探索，可能还有更多仍有待于鉴定。真菌通常会引起流行病爆发，可使昆虫数量减少90%以上。此类情况多见于毛虫、蚜虫、甲虫甚至家蝇。一个多世纪以来，科学家们一直热衷于利用这些病原体作为生物控制剂来防治传播植物病毒病的蚜虫以及传播疟疾的蚊子等农业害虫和病媒种群。与细菌和病毒不同，作为触杀型杀虫剂的真菌可直接穿透昆虫表皮，这使它们尤其适合于开发生物杀虫剂。昆虫病原真菌侵染和发育过程的关键阶段为：孢子附着于昆虫表皮，孢子萌发，膨大“吸附器”(附着胞)的分化，表皮穿透，血腔定殖和孢子形成，之后出现染病虫尸。在真菌侵染过程中，昆虫自身的强大抗菌防御作用成为昆虫致病性进化的屏障：具有广泛寄主范围的非专化性昆虫病原菌相对较少。但可能有成千上万的特异物种已经进化，能“解开”单一昆虫物种或几个极近缘昆虫物种的“锁”。由于这些真菌通常很难人工培养，因此对它们克服寄主的防御共同进化的机制知之甚少。系统发育学研究表明，尽管昆虫病原的侵入和发育过程大致相似，但昆虫致病性代表了生存方式的适应性，这在真菌纲所有主要门中通过趋同进化而独立且频繁重复出现。因此，各主要类群在寄主范围、致病策略和分子机制等方面存在显著差异。如子囊菌的寄主范围通常较广，病菌可产生毒素杀死寄主，而昆虫病原真菌通常是通过在昆虫体内破坏性生长特异性杀死寄主，寄主范围较窄。但即使是同属肉座菌目(Hypocreales)的亲缘子囊菌，如绿僵菌和白僵菌，它们用来黏附寄主、穿透寄主表皮和克服寄主防御的蛋白质也各不相同。它们提供了可组合于单个病原体载体中的大量基因，使环境持久性和毒性最大化。昆虫病原真菌具有高度的特异性，对环境安全，通常毒性极强，可引起大范围昆虫流行病。然而，它们中的大多数难以人工培养，因此更易用于典型生物防治方案，而不是作为广泛使用的杀菌剂(mycobiocides)。人们聚焦于开发肉座菌目真菌作为生物防治剂，因为它们的寄主范围相对较广，而且易于大规模生产。目前市面上大约80%的昆虫病原真菌产品是基于绿僵菌属和白僵菌属的。绿僵菌和白僵菌均天然存在于世界各地不同生境的土壤中。它们具有根际能力，可以内生菌的形式存在并表现出“菌根”特征，将氮从受感染的昆虫转移到寄主植物，从而提取光合产物碳。尚不清楚这些真菌究竟如何进化以杀死节肢动物(昆虫、蜱和螨虫)，尽管假设它们起初为植物共生体，它们的寄主范围扩大到可利用昆虫作为氮源来保持互惠共生的植物内共生。各菌株已经明显地对昆虫产生了不同程度的特异性和毒力，但它们共同靶向大多数昆虫，包括鞘翅目、半翅目以及罕见发生细菌或病毒病的直翅目昆虫。

随着工业生产自动化的成功，绿僵菌商业化的成本与传统化学杀虫剂相当。尽管如此，因为真菌病原体不稳定的田间表现和低毒力(即杀灭速度缓慢和接种量需求高)已将大部分市场让给了它们的化学竞争者。正如杀灭速度缓慢可能是许多病原体的天然劣势一样，低毒力可能也是内在的，特别是如果它与抑制产孢具有相关性。寄主范围狭窄的绿僵菌的杀灭速度缓慢，如蝗虫特异性蝗绿僵菌(Metarhizium acridum)，这与在活体寄主内生长时优化利用营养物的策略相关。在这些情况下，经济有效的生物防治将需要对真菌进行遗传修饰，以提高低孢子剂量的杀灭速度。田间效果的不一致性主要是由于昆虫病原真菌对环境胁迫，特别是紫外线的敏感性所致。

基因工程结合对真菌致病机制和生态学的深入理解，通过增强真菌对环境胁迫的耐受性及其毒力，为提高真菌杀虫剂的功效和经济有效性提供了无数的机会。本文综述了这个新兴领域中一些最有发展前景的方面，讨论了引起菌株演变的途径：⑴ 增加角质层降解，更快侵入寄主；⑵ 经由杀虫毒素的表达使昆虫迅速停止取食并被麻痹；⑶ 改造限定昆虫寄主范围；⑷ 增加对非生物胁迫的抗逆性；⑸ 切断传播人类病原体的能力。

1 昆虫病原真菌基因工程方法

昆虫病原真菌生产商希望得到杀灭速度快、寄主范围广且在不同环境条件下都能发挥作用的菌株，即与化学杀虫剂药效相当的菌株。传统的提高病原菌功效的方法一般是建立在生产过程中对真菌进行生理调控，或者开发更好的剂型和应用方案的基础上。在这些领域会继续发展。农杆菌介导的转化在绿僵菌和白僵菌中已很高效。利用农杆菌插入诱变技术对罗伯茨绿僵菌(Metarhizium robertsii)进行全基因组功能筛选，发现了与产孢和毒力增强相关的基因。近期已利用成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)-Cas 9(CRISPR相关蛋白9)方法对白僵菌进行了改良，其他昆虫病原真菌必将很快跟进应用此法。

2 基因工程增强毒力

提高毒力基因工程的重点是缩短杀死时间[即缩短致死时间(LT50)，图1]和降低所需的致死分生孢子剂量[即降低真菌的致死剂量(LD50)，图 2]。致命侵染所需真菌量的降低实现了经济有效的防治，提高了田间持效性。因此，尽管分生孢子活力会随着时间的推移而下降，但昆虫仍可能接触到超过致死阈值的基因工程真菌繁殖体。通过改造昆虫病原真菌表达靶向寄主角质层的内源蛋白，靶向激素和昆虫生理的昆虫蛋白，来自昆虫天敌和其他昆虫病原体的神经毒性肽以及合成基因，已经实现了毒力增强(图3)。这些测试的转基因使寄主的存活时间缩短了 19%～43%(图 1)。

2.1 利用昆虫病原真菌本身作为菌株改良基因来源

不同昆虫病原菌的致病性独立进化，有许多因素影响毒力。因此，尽管角质层侵入和逃避寄主免疫系统可能必然是致病性的共同特性，但独立进化的病原体会以不同的方式达到这些目标。球孢白僵菌(Beauveria bassiana)、蛹虫草(Cordyceps militaris)和几种绿僵菌的完整序列正在揭示昆虫致病性的趋同进化和寄主转换现象的机制。已证明对阶段特异性基因表达和调节真菌寄主范围的信号转导途径的精细表征对成功开发具有毒力增强的转基因生物杀虫剂极有价值。

图1 由转化到昆虫病原真菌基因组中的基因所产生的LT50改良

2.1.1 利用天然酶穿透昆虫角质层

角质层降解酶由单个基因编码，易于进行基因转移，因此是基因工程增强毒力的令人关注的初步候选物。昆虫角质层主要由嵌入蛋白质基质中的几丁质原纤维组成。真菌蛋白酶和几丁质酶是大基因家族的产物，对角质层溶解有增效作用。具有独特活性谱的多基因产物增加了天然可用于开发生物技术方法的工具的范围和精度。此外，这些酶还具有与相关腐生菌产生的类似蛋白质不同的致病特异性。例如，由于罗伯茨绿僵菌枯草杆菌蛋白酶 Pr1表面带正电荷的氨基酸的较强结合有助于增加其对角质层的活性。与腐生菌产生的类似蛋白酶相比，它的活性提高了33倍。即使在模拟昆虫防御反应的快速黑化环境中，Pr1也对蛋白酶抑制剂具有抗性。

大多数这些基因的表达受到严格调控，因此酶仅在其底物存在时产生，避免产生被寄主免疫系统识别为外源的蛋白质。第一种具有增强毒力的重组病原体组成型过表达角质层降解蛋白酶。构建该转基因菌株以确定对寄主角质层的进一步破坏是否有助于寄主昆虫体内的真菌扩展并提高杀灭速度。但在烟草天蛾(Manduca sexta)体内的罗伯茨绿僵菌Pr1组成型表达激活了寄主蛋白酶，其反过来引发体腔中的大量黑化，导致存活时间减少 25% (LT50)，而不是有利于真菌扩展。后来发现黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)血淋巴中的一种免疫相关蛋白酶(Persephone)可特异性地引发对类Pr1真菌蛋白酶的免疫应答。这可能解释了为什么野生型罗伯茨绿僵菌一旦穿透昆虫角质层进入血淋巴就停止表达蛋白酶基因。即使采用单个生物体时，基因工程研究也可能无法实现预期的效果，如本例所示，病原体的效果可能极难预测，因为寄主和病原体间可能存在无法预料的相互作用。但被转基因菌株杀死的大量黑化昆虫不利于真菌生长和孢子形成，减少了重组真菌的传播。这有助于美国环保署批准对罗伯茨绿僵菌 Pr1过表达菌株进行田间试验，从而为后续试验奠定基础。该试验也是在罗伯茨绿僵菌中首次采用绿色荧光蛋白(GFP)标记，借助荧光标签偶然发现该菌具有根际能力。

图2 由转化到昆虫病原真菌基因组中的基因所产生的LC50改良

图3 毒力增强图解：修饰昆虫病原菌以增加毒力的主要方法

构建过量生成球孢白僵菌几丁质酶CHIT1使寄主存活时间下降了23%，即与Pr1的作用类似。罗伯茨绿僵菌 Pr1A的表达也可提高球孢白僵菌的杀灭速度，表明来自一种昆虫病原真菌的致病相关基因可用于增强其他昆虫病原真菌的毒力。也测试了角质层降解酶组合，发现具有增效性，在某些情况下可增强毒力。一株基因工程球孢白僵菌类Pr1蛋白酶BbCDPE1(球孢白僵菌类Pr1蛋白酶)和几丁质酶CHIT1同时过表达菌株对杀灭时间和致死剂量的降低，明显大于各自单独表达。

2.1.2 设计合成来自昆虫病原真菌的基因

通过合成生物学，科学家们可以突破自然存在的蛋白质序列：可进一步创造杂交其他基因中发现的活性或者具有从未在自然界中进化过的新功能的杂交基因。角质层是合成蛋白质工程方法的第一个目标。白僵菌含有类Pr1A蛋白酶CDEP1和几丁质酶Bbchit1的融合蛋白CDEP1︰Bbchit1的表达促进了对昆虫角质层的穿透，其程度大于单独 Pr1A或Bbchit1过表达。据推测，这种效应是由于角质层蛋白的蛋白酶解暴露出几丁质，然后附带的几丁质酶发挥作用所致。

昆虫基因的功能结构域与昆虫病原体基因的融合可以产生具有新颖增强作用的蛋白质。球孢白僵菌的几丁质酶 Bbchit1缺少典型的几丁质结合结构域。已经构建了几种Bbchit1与源于植物、细菌和昆虫的几丁质结合结构域融合的球孢白僵菌杂种几丁质酶。Bbchit1与源于家蚕(Bombyx mori)几丁质酶的几丁质结合结构域的融合表明，与几丁质和昆虫角质层结合的性能提高最多，其在白僵菌中的表达导致寄主昆虫比感染过表达天然几丁质酶真菌的更快地死亡。与野生型菌株以及过表达单一天然蛋白酶的菌株相比，家蚕几丁质结合结构域与类Pr1A蛋白酶 BbCDEP1结合几丁质的融合从昆虫角质层中释放出更多的肽，显著增强了球孢白僵菌的毒力。绿僵菌和白僵菌非常适合转化，它们可以作为基因改组(gene shuffling)的模型系统，尤其适用于筛选新的效应子或合成基因。一旦表征，最佳候选者就可以通过昆虫或植物等试验较少易于处理的系统来实现。

2.1.3 增强血淋巴养分

昆虫病原真菌必须合成不同类别的酶，以穿透角质层进而在血淋巴中增殖，它们能利用碳水化合物。蝗绿僵菌分泌一种可利用海藻糖的海藻糖酶(酸性海藻糖酶绿僵菌1或ATM1)，海藻糖是大多数昆虫血淋巴中的主要糖类。ATM1的过表达加速了蝗虫血腔中蝗绿僵菌的生长，其LC50是野生型菌株的1/8甚至更低。因此，增强昆虫病原真菌利用寄主营养的方法是提高毒力的一种可行方法。

2.1.4 改变寄主范围

最近对控制昆虫病原真菌的寄主特异性的分子机制的深刻了解已能表征寄主范围相关基因。对越来越多的昆虫病原体测序基因组的研究将能表征全部致病性和寄主特异性相关基因。通过了解这些基因的功能，有可能创造兼具昆虫特异性和毒力增强的昆虫病原真菌。这种研究方法的潜力已经展现出来了。将一个酯酶基因(绿僵菌酯酶1或Mest1)从多寄主的罗伯茨绿僵菌转移到蝗虫特异性蝗绿僵菌中，可使后者的宿主范围扩大，包括毛虫。

2.2 寄主昆虫蛋白在昆虫病原真菌中表达

2.2.1 基因工程寄主向病原菌基因转移

水平基因转移(horizontal gene transfer)的全基因组分析显示，绿僵菌已获取了来自其他微生物(如细菌和古细菌)，甚至其他真核生物(如节肢动物、植物和脊椎动物)的多种组合。例如，从昆虫获得的一个甾醇转运体(罗伯茨绿僵菌 Neimann-Pick C2型或Mr-NPC2a)，可使真菌与寄主竞争血淋巴中的生长限制性甾醇。通过将甾醇载体基因转移到缺少内源Mr-NPC2a同源物的球孢白僵菌中来复制该进化，从而提高其致病性。

2.2.2 利用寄主内环境平衡(homeostasis)

在水平获取Mr-NPC2a发现报道之前，已构建了几种表达其寄主昆虫自身分子的重组真菌。利尿激素调节昆虫水/盐平衡；烟草天蛾利尿激素(MSDH)的表达显著增加了球孢白僵菌对鳞翅目害虫和黄热病传播媒介蚊子的毒力。一个重要免疫相关信号通路(Toll信号通路)的抑制性调节因子的表达也增加了球孢白僵菌对蜡螟(Galleria mellonella)和桃蚜成虫(Myzus persicae)的毒力。因此，使一个在昆虫体内正常无活性的分类学保守分子偶尔具有活性可增加昆虫病原真菌对各种昆虫的毒力。反之，利用对靶标昆虫特异的分子可以特异性地增加昆虫病原真菌对这些昆虫的毒力。胰蛋白酶调节抑制(“卵巢抑制”)因子(TMOF)抑制胰蛋白酶的合成，胰蛋白酶用于蚊子吸血后消化肠道中的食物。来自埃及伊蚊的TMOF在球孢白僵菌中的表达使对成虫和幼虫的杀灭速度加快，但对麻蝇(Sarcophaga bullata)无此效果。推测昆虫间不同的TMOF序列是基因工程球孢白僵菌寄主范围较窄改善的原因。类似地，在球孢白僵菌中表达来自火蚁(Solenopsis invicta)的种特异性的焦激肽(pyrokinin)β-神经肽可更快杀死火蚁，但对鳞翅目昆虫无效。

目前利用的增加昆虫病原真菌毒力的昆虫分子涉及5个生化过程：甾醇凝血、渗透平衡、食物消化、免疫和神经系统功能。从理论上讲，昆虫的任何生化过程都可能成为被破坏的靶标；因此，可以利用组合不同的昆虫分子的昆虫生物学，来构建对靶标害虫具有高度特异性的更具毒力的真菌菌株。

2.3 来自昆虫天敌和其他昆虫病原菌的基因的表达

2.3.1 将节肢动物源毒素转入昆虫病原真菌

编码从蜘蛛和蝎子分离的昆虫特异性毒素的各种基因已被引入到绿僵菌或白僵菌的基因组中。这些毒素通常通过靶向一个或多个主要离子通道(例如Na+，K+，Ca+和Cl-)而使昆虫出现快速麻痹，从而产生一些杀虫迅速的重组真菌。

早期受到关注的是蝎子兴奋性钠通道阻断剂AaIT1。将 AaIT1[黄肥尾蝎(Androctonus australis)昆虫毒素]基因插入寄主范围广泛的金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)菌株(ARSEF 549)中，可使对多种昆虫的杀灭时间减少 40%，致死剂量(孢子)减少至 1/9～1/22。类似地，将来自东亚钳蝎[Buthus martensi(Karsch)]的蝎毒素 BmKit(东亚钳蝎昆虫毒素)基因插入另一种寄主范围广泛的昆虫病原真菌蜡蚧轮枝菌(Lecanicillium lecanii)，使致死剂量减少至1/7.1，半数存活时间减少26.5%。在一些情况下，寄主死亡速度快，相应的虫尸上子代分生孢子的量下降，这可能是由于死亡前寄主血腔中的菌丝体生长减少了。因此，节肢动物毒素赋予的加快杀灭速度与真菌繁殖可能互为消长。但不同寄主对分生孢子产量的影响不一致，表明毒素表达对真菌繁殖的影响可能取决于真菌种类和毒素。

诸如金龟子绿僵菌和蜡蚧轮枝菌等广寄主菌提供了用于生物测定毒素对多种害虫作用的合适载体，但出于安全和监管要求，须对非靶标生物无风险的特定菌株才可应用。此外，专家可以特别受益于这项技术，因为它们通常会更慢地杀死。例如，使用蝗绿僵菌的缺点是蝗虫从侵染到死亡需要几天时间。这需要防止应用于跳蝻(蝗虫若虫)的真菌超过防治经济阈值。利用来自黑背以色列金蝎(Leiurus quinquestriatus hebraeus)的LqhIT2(黑背以色列金蝎昆虫毒素)和来自朱迪亚黑蝎 Buthotus judaicus的BjαIT(Buthotus judaicus昆虫毒素)提高了蝗绿僵菌的毒力。除了AaIT1，还有来自漏斗网蜘蛛Hadronyche versuta和Atrax robustus的几种编码昆虫特异性毒素的基因也被插入蝗绿僵菌中，包括 κ-HXTX-Hv1c(hexatoxin-high voltage activated 1c；Ca2+激活 K+通道的抑制剂)、混合毒素[阻断CaV和KCa通道的自增效(self-synergizing)肽毒素]和ω-HXTX-Hv1a(昆虫电压门控钙通道的阻断剂)。4种神经毒素都通过减少致死剂量、杀灭时间和取食来提高蝗绿僵菌对蝗虫的药效，毒素联用显示增效作用，改善毒性效应，包括取食减少 78%。但重组菌株保留了寄主特异性，对非蝗虫类不致病：这可能是因为特异性主要取决于空间和时间上与转基因表达分离的表皮层的反应。

应用发展最迅速的是针对疾病媒介的真菌。疟疾是致死率最高的媒介传播疾病，每年造成120多万人死亡，其中大多数是5岁以下的非洲儿童。一株防治蚊子的寄主专一性平沙绿僵菌(Metarhizium pingshaense)菌株的毒力通过同时表达AaIT1和混合毒素得到了极大的提高。然而，即使是单独表达混合毒素的平沙绿僵菌，感染5 d后也会使摄食活性(进而传播可能)减少 60%以上。考虑到转基因昆虫病原体造成的死亡率，不足20%的蚊子存活，在感染5 d后寻找寄主，超过了世界卫生组织(WHO)判定一项成功的病媒防治技术所设的阈值。

蜘蛛毒液中的大部分肽用于麻痹猎物，其他肽则具有抗菌作用，可能是用于防治蜘蛛在吸食猎物体液时遇到的传染性微生物。帝王蝎(Pandinus imperator)抗菌scorpine与昆虫抗菌天蚕素(cecropins)和防御素相似，但它对伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)的效力比后者高100倍。众所周知，蚊子易于对防治药剂出现抗性，但使用杀灭速度缓慢的绿僵菌菌株(使蚊子的产卵量减少)可以减轻对蚊子的选择压力，减缓对生物农药的抗药性进化。一株表达scorpine或scorpine与唾液腺结合的SM1(唾液腺和中肠肽 1)肽的融合蛋白的金龟子绿僵菌菌株可使感染性疟原虫的数量减少97%以上。

2.3.2 利用细菌性毒素增加毒力

在另一个相关的研究方法中，昆虫致病细菌和病毒也被作为具新颖作用机制的毒素的来源。来源于苏云金杆菌(Bt)的昆虫特异性毒素作用于靶标昆虫的中肠上皮组织。因此，在角质层或体腔内真菌递送Bt毒素不会增强杀虫效力。Bt营养期杀虫蛋白(Vip)Vip3A的表达没有增强寄主表皮应用的球孢白僵菌分生孢子的侵染性，但是与野生型菌株相比，转化体在被摄取后有致死效应。这种双重作用机制的优点是可以角质层侵染和经口毒性结合杀死昆虫。一项田间试验表明，重组菌株的防效与类似化学药剂相当，且对非靶标节肢动物无不利影响。

3 避免非生物胁迫

3.1 预防紫外线(UV)损伤

真菌源杀虫剂的田间效果通常受限于其对非生物胁迫(如UV辐射和温度)的敏感性。加速生长筛选已经成功用于鉴定金龟子绿僵菌紫外诱导突变体的抗逆性和超强毒力。然而，已应用基因工程技术来提高对环境胁迫的耐受性，以生成在不同条件下作用稳定、持效期长的产品。紫外线辐射是暴露于光照的真菌源农药(如应用于叶部药剂)最具挑战性的环境因子。紫外线辐射主要通过诱导碱基化学修饰来破坏 DNA，其中大多数是环丁烷嘧啶二聚体(CPD)。这些光损伤主要通过罗伯茨绿僵菌的光复活作用消除。但其天然CPD光裂合酶不足以抵抗由7 h太阳辐射引起的CPD损伤和预防活力损失。非常耐紫外线的嗜盐菌(Halobacterium)光解酶的表达使罗伯茨绿僵菌和球孢白僵菌的光照存活率提高了 30倍以上。与野生型菌株不同，表达嗜盐菌光裂合酶的罗伯茨绿僵菌或球孢白僵菌暴露于光照下几小时后仍对冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)具有毒力。

除了直接损伤DNA外，紫外线辐射还通过产生反应性氧化物(ROS)来提高氧化应激反应。超氧化物歧化酶(SOD)过表达增强了球孢白僵菌对 ROS的解毒能力，增强了对紫外线的耐受性。类似地，细菌大肠杆菌(Escherichia coli)硫氧还蛋白(trxA)的表达提高了球孢白僵菌对UV-B辐射、氧化和热的耐受性。

分生孢子细胞表面的色素充当真菌细胞免受紫外线伤害的保护层，但球孢白僵菌不产生可见色素。烟曲霉(Aspergilllus fumigatus)酪氨酸酶的表达激活了球孢白僵菌色素的生成，使分生孢子对紫外线辐射的耐受性增强了。罗伯茨绿僵菌分生孢子的细胞壁呈深绿色，但并非是可增强许多其他真菌的紫外线耐受性的二羟基萘-黑色素(DHN-黑色素)。交链格孢菌(Alternaria alternata)的DHN合成途径转入金龟子绿僵菌后，菌株对紫外线辐射的耐受性加倍。该途径还增强了对热(35 ℃)和低水分活度(水分活度=97.1%)的耐受性，表明黑色素可使生物对多种非生物胁迫均有耐受性。更令人惊讶的是，DHN-黑色素增强了金龟子绿僵菌对昆虫的毒力，孢子萌发和附着胞(侵染结构)形成加速，毒性基因表达增加。据推测，毒力的增加是由于真菌在昆虫体内的抗逆性增强所致。DHN-黑色素合成途径相关基因也可能参与侵染过程。参与罗伯茨绿僵菌分生孢子色素合成的漆酶基因也有助于附着胞细胞壁刚性，从而它们产生的膨胀压力促进角质层渗透。

3.2 增强耐热性

极端温度也会影响害虫防治剂的有效性，在全球变暖的时代，如果害虫比它们的一些天敌适应性更强，这可能成为更大的影响因素。与紫外线辐射一样，热胁迫会产生ROS。小热休克蛋白(HSPs)也赋予许多生物体耐热性，热胁迫下过量表达HSP25的罗伯茨绿僵菌在昆虫体内的生长增加。在一种明显不同的方法中，将罗伯茨绿僵菌暴露于递增热胁迫连续培养，产生耐热变体，其在37 ℃下生长良好，同时保持野生型的致病性等级。这表明试验进化(experimental evolution)为开发新的害虫治理方案提供了空间。但由于昆虫和哺乳动物的真菌病原体破坏蛋白质外壳和避开寄主天然免疫系统的侵染策略非常相似，因此采用在人体温下可以繁殖的昆虫病原体需慎重考虑。

4 靶基因在基因工程昆虫病原真菌中的表达

在开发一种生物体作为基因工程项目的载体时，有意地调节同源和异源基因的表达是一个重要的目标。这可以通过积累绑定RNA聚合酶和转录因子(启动子)调节基因转录的DNA片段的工具箱来实现。基因工程初期，异源基因在构巢曲霉(Aspergillus nidulans)甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GPDA)等强组成型启动子控制下在金龟子绿僵菌中表达。后来发现球孢白僵菌和蝗绿僵菌 GPD基因的天然启动子在它们各自的物种中比构巢曲霉 GPD启动子的活性明显更强。一种具有更强活性的天然启动子是球孢白僵菌 I类疏水蛋白，其在球孢白僵菌的几乎所有发育阶段均可表达。该启动子截短的 1290-bp片段甚至具有更强的活性，用于促进上述中肠特异性毒素Vip3A的表达。

发育期特异性启动子只在真菌的某些发育阶段促进定向基因表达，可使转基因靶向表达。一个重要的目的是采用受昆虫相关信号严格控制的启动子，以确保靶向配置昆虫特异性毒素。绿僵菌类胶原蛋白MCL1是昆虫血淋巴中防御吞噬作用所必需的一种高表达基因。利用MCL1启动子促进转基因表达，确保转基因基因在昆虫体腔内表达，而不是在昆虫外部表达。MCL1启动子是目前唯一用于昆虫病原真菌基因工程的发育期特异性启动子。随着昆虫体内真菌发育全基因组表征，更多的发育期特异性启动子正在被鉴定。例如，上述甾醇载体基因Mr-NPC2A是从T-DNA随机插入突变体库分析鉴定而来。从生物工程的角度特别令人感兴趣的是，当使用 Mr-NPC2A 启动子—绿色荧光蛋白(GFP)报告基因融合时，Mr-NPC2A只在活体昆虫中表达。定位表达不可预测，不筛选防治昆虫的随机突变体便不会发现Mr-NPC2A的作用。这与MCL1启动子形成对比，后者在体外提取的昆虫血淋巴中也有表达。

5 对转基因昆虫病原真菌风险的防范

5.1 转基因昆虫病原菌生命周期控制

与其他转基因生物一样，基因工程昆虫病原真菌也存在安全性问题。作为预防措施，限制重组病原体在田间的持效期和繁殖是一预防措施。为此，已有人提议应修饰转基因菌株使其生态学弱化(ecologically enfeebled)，从而降低对田间本地菌株的竞争力。实现这一目标的研究工作包括敲除内源性胁迫防御基因，尽管科学家同时生成其他具有更高抗逆性的菌株。因此，罗伯茨绿僵菌光复活系统的缺失导致对紫外线辐射具有超敏性。UV-超敏性也是超毒力的菌株在防治蚊子尤时为有效，因为这些基因工程菌株不会从施用部位(如蚊子捕捉器或房屋)扩散到环境中。

对昆虫病原真菌适应环境的机制有了深入了解，鉴定了许多可用于降低不同环境中生态适合度的其他靶标。例如，干扰能使绿僵菌适应寒冷的RNA结合蛋白，将大大降低绿僵菌越冬能力。这将使真菌能够在整个生长季节内发挥作用。已证明由球孢白僵菌在寄主死亡后产生的卵孢霉素(oosporein)可抑制细菌性竞争者，使真菌能充分利用寄主虫尸来获取营养。因此，卵孢霉素的生物合成的中断可通过减少虫尸产孢而减少传播。一旦表征，可利用卵孢霉素等许多次级代谢物的生物合成途径来限制真菌病原体的生命周期。

罗伯茨绿僵菌不仅是昆虫病原体，也作为根际真菌在根系定殖，与植物建立了互惠共生关系。植物根部特异性黏附素(Metarhizium adhesion 2，MAD2)和寡糖转运体(Metarhizium raffinose Transporter，MRT)等几种基因对罗伯茨绿僵菌的根际竞争力很重要。破坏这些基因可显著降低该菌在土壤中的持效性，但不会影响对昆虫的致病性。用无根际竞争力的菌株作为基因工程的框架提高毒力将会生成在环境中存活不良的超毒力菌株。参与罗伯茨绿僵菌和植物间互作的还有许多其他基因，同样可以删除它们以降低该菌在田间的根际竞争力。

5.2 转基因切除(excision)

不降低转基因菌株竞争优势性的方法是设计一种转基因一旦发挥作用就从基因组中选择性地被切除的系统。基于Cre重组酶-loxP位点重组系统的转基因去除方法可用于基因工程昆虫病原真菌。在罗伯茨绿僵菌中，Cre重组酶的表达能通过吻合法(anastomosis)切除两侧为 loxP位点的整合转基因。所得菌株不含转基因，仅保留 LoxP识别位点的短DNA片段。该方法的进一步开发可用于产生最初具超强毒力，但经昆虫寄主一次或多次传代后恢复到野生型毒力水平的菌株。

6 对转基因昆虫病原真菌出现抗性的可能性

“昆虫是否会对生物防治剂产生抗性”是一个常见问题。由于大多数工程改造生物防治剂的毒力较高，显而易见寄主产生抗药性的选择压力随之应该更大。最近的一项研究表明，一组188个完全测序的、野生捕获的黑腹果蝇品系对金龟子绿僵菌的寄主防御出现显著变化。在来自相同地理区域的这些品系中观察到的抗性遗传变体累积进而出现抗性进化，对生物农药可持续性具有影响。

通过比较选择性(耐受)与非选择性蜡螟幼虫的防御和胁迫基因研究了抗病性的进化。对球孢白僵菌侵染的反应包括将更多资源分配至对抗真菌的主要屏障角质层，如增强角质层酚氧化酶的表达以及胁迫处理因子(如抗氧化剂)。该反应为对球孢白僵菌所特有，因为它并不能阻碍金龟子绿僵菌。类似地，连续5代烟粉虱(Bemisia tabaci)被Isaria fumerosa侵染，而在此选择后没有表现出抗性进化。尽管如此，为了提高真菌效果同时防止或延缓抗性进化，可能需要在同一真菌中含有多个增强毒力的基因，或者采用几种真菌，每种使用不同作用机制的不同毒素，以提高毒性和加强抗性治理。

7 结 语

基因工程和合成生物学手段所提供的强大力量克服了限制生物防治剂开发的对非生物胁迫的低耐受性和低毒力问题。随着毒力基因和昆虫弱点的快速发现，基因工程可以产生取之不尽、用之不竭的抗虫蛋白库。考虑到新颖害虫治理技术的迅速积累，监管障碍比技术障碍更可能限制这些技术的发展。

最近开发的基因编辑工具CRISPR因其高精度可能面对较少的监管和应用障碍。与以前的方法相比，CRISPR/CAS 9在技术上的挑战性较低，增加了更广泛开发转基因生物防治剂的前景，这一工具已经成功应用于球孢白僵菌。

目前有建议使用CRISPR/Case 9改变昆虫基因组，改变基因调控，以便于害虫治理。若与基因驱动(gene drive)结合，一种转基因昆虫有可能取代野生型。鉴于这一可能性，目前的使用仅限于采取严格限制措施的实验室，对有害基因在害虫种群中不可逆转的扩展的担忧可能会阻碍基因驱动生物的田间应用。一种低风险的替代方法是采用克隆繁殖的生物防治剂，如绿僵菌，携带有利于病原体存活性状，而非目前提议的有害性状。目前正在汇集分子生物学知识和技术，以便能够创造具有寄主专一性的微生物(如蚊子)，因比化学药剂在环境中具有更长持效期，故防治成本更低廉。这类菌株的生产和利用可能面临巨大的监管障碍，但好处也很多。

鉴于转基因植物在世界大部分地区日益被公众接受，如果人们对其独特生物学的了解继续增加，并采取适当的措施确保公众接受，那么转基因杀虫微生物的田间应用前景光明。预计，在20～30年内，生物农药市场可能被真菌(如绿僵菌)所主导，有大量的转基因菌株可用于解决害物治理问题。但更有可能的是，这些菌株不会成为害物治理的灵丹妙药，而是与其他手段综合构成一个商业上可行的、可持续的长期害物治理方案。生物技术可以为全球面临的许多作物害虫、杂草和病害问题提供解决办法，但与转基因作物不同的是，这些转基因技术大多尚处于非常初期的开发阶段。监管机构愿意解决这些技术在开发过程中面临的问题，但这一工作需要明确而有力的推动力，比如防治病媒传播疾病的可能性。