防治植物病原菌的植物提取物制剂

韩 悠 编译

(上海市农药研究所，上海 200032)

植物次生代谢会合成多种生物活性物质以抗御害虫、病原菌以及抑制其他植物生长。精油和植物提取物中含有生物碱、氰苷、萜类、多炔类(polyacelylenes)和聚噻吩类(polythienyls)等众多生物活性物质。研究人员探讨了这些分子的多样性及其在害虫和病原菌综合治理中的应用。基于植物提取物和精油的产品在许多国家都可用于防治植物病害。然而，尽管农药市场对植物制剂的需求量巨大，特别是对环保治理农业害虫的需求日益高涨，但植物源制剂的数量仍然有限。

植物病理学研究最常见的情形是，利用粗产物状态的提取物和精油防治真菌、细菌和线虫。在受控条件下，不同植物的提取物和精油对植物病原菌有抑制作用。但通常极难在大田观察到如实验室或温室试验取得的良好结果。田间条件下生物活性物质的降解和挥发是造成植物源产品功效下降的主要因素。因此，由于生物活性物质的损失，致使某些用于农业的植物材料的潜在适用性最终被低估了。避免这些弊端的选择之一是使用聚合物、增塑剂、稳定剂和可生物降解的抗氧化剂来制备生物活性植物产品。

根据制剂类型，使用聚合物、乳化剂、表面活性剂、溶剂、稳定剂、消泡剂和其他成分以确保生物活性化合物的稳定性、黏附性和缓释性。含植物活性成分的缓释液体和固体制剂的例子在医药、制药、食品技术和美容业等一些领域很常见。在农业领域，尽管这些技术是治理种子、土壤传播和获后病原菌的令人关注的选择，但缓释剂的应用还处于初级阶段。在这种制剂中，活性成分随着时间的推移被释放到环境中，这一特性具有减少活性成分的损失，延长持效期以及减少对动植物的毒性的优点。

根据用于包封(encapsulation)的方法和材料，制备工艺大有不同，但重要的是制备植物源提取物制剂用于试验，而不是使用它们粗产物。Darlan Ferreira Borges等探讨了植物提取物、精油及其分离的活性化合物制剂对植物病原菌的应用潜力，提出了制备可用于植物病理学研究和相关领域的制剂的方案。

图1 喷雾干燥形成颗粒

1 包封的主要方法

1.1 雾化法(喷雾干燥)

这一工艺包括3个步骤：首先，将产品(如提取物和精油)以液滴的形式分散，从而增加了产品的表面积。第二，分散的液滴与加热的气流接触，第三，溶剂被蒸发，形成固体颗粒(图1)。这在工业化中属低成本工艺，特别是精油的微囊化。

喷雾干燥法制备的制剂对植物病原体的防治至今尚未进行广泛探究。仅有少数几例，如咖啡叶提取物或没食子酸的制剂被用作植物抗性诱导剂或用于防治紫丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae pv.tomato)。

1.2 冻干法(冷冻干燥)

在冷冻干燥过程中，产品(提取物或油)被迅速冷冻，从而保持其化学特性。在接下来的步骤中，冷冻的材料进行局部真空处理。然后，通过升华将冰或其他冷冻溶剂从材料中除去，将产品干燥至约2%湿基。粉碎脱水后的固体物料至所需粒度。

一些植物的冻干提取物具有杀菌活性。芸香(Ruta graveolens)的冻干提取物能抑制植物病原真菌链孢菌(Fusarium solani)、番茄棘壳孢(Pyrenochaeta lycopersici)、根串珠霉(Thielaviopsis basicola)、大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)和青霉菌的菌丝生长。而天竺葵(Pelargonium sp.)、鼠尾草(Salvia officinalis)、薰衣草(Lavandula officinalis)、唇萼薄荷(Mentha pulegium)和亚洲薄荷(Mentha arvensis)的冻干提取物则可使大豆锈病病菌(Phakopsora pachyrhizi)的孢子萌发率降低85%。

1.3 脂质体包裹法(乳剂)

乳剂的定义为含有至少2种不可混溶的液相的热力学不稳定体系，其中一相含有的胶体颗粒分散于另一相中。纳米乳(nanoemulsions)是研究最多的乳剂类型。它们为无色微乳液，液滴大小为50～200 nm，而常规乳剂呈现大小为1～1 00 μm的蓝色液滴。与常规乳剂相比，纳米乳具有更高的动力学和热力学稳定性，更易于扩散和纳米颗粒转运，强化了对亲水或亲脂分子在其分散相中的掺入和保护。例如，对纳米乳液微囊化所制得的产品，有利于植物化学物质跨细胞膜的转运。

精油和植物提取物的乳剂是防治植物病害值得推荐的方法。例如，肉桂、柠檬和佛手柑精油纳米胶囊对黑曲霉(Aspergillus niger)具有抗菌活性。其他值得注意的例子有玫瑰草(palmarosa)精油纳米乳可抑制草莓黄单胞菌(Xanthomonas fragariae)，印楝(Azadirachta indica A. Juss)和亚香茅[Cymbopogon nardus(L)Rendle]精油纳米乳可抑制立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)和齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)。

1.4 挤压-浇铸法

在该方法中，将乳液/提取物芯和涂层材料(海藻酸钠、乙酸盐、淀粉等)通过移液管或喷嘴在高压下加入某离子溶液中，如氯化钙溶液，边加边搅拌。20 min后收集凝胶微球并干燥。微球壁的阻力取决于制剂的组分和颗粒与离子溶液的吸附时间。必须注意尽量减少或避免在包封过程和储存期间活性化合物损失。

挤压包封的植物提取物和精油可用于食品保藏，例如轻度加工的苹果和蘑菇。然而，利用这种技术对防治植物病害的植物源提取物的制剂技术并未进行系统研究。

1.5 流化床法

流化床涂层即在流化粉末床上喷涂包封剂。被包封的物料在特定温度下以固态悬浮于煤气体流，喷涂液体包封材料的雾滴，在物料颗粒上形成一层薄液膜。最后，材料经润湿和干燥形成一牢固的均质层。物料循环速率、喷嘴雾化压力、湿度和涂层温度都会影响涂层的效率。流化床法广泛应用于制药和食品工业，也可用于合成农药、染料和其他工业化学品。

与喷雾干燥法相比，此技术制备的颗粒活性化合物含量更高，流动性更好，涂覆率更高。有望使用该工艺制备用于防治土壤传播病原体的缓释剂产品。这种方法的另一个优点是，除了具有高度的可控性和自动化之外，还可以进行大批量应用，即颗粒循环时间短，热传输量大。Śmigielski等人(2011年)观察到薰衣草(L. angustifolia)精油在干燥过程中损失率超过40%。然而，如果在具干燥剂和热交换器的密闭循环系统中，通过流化床干燥植物的鲜生物量，所得产物中的挥发性和生物活性的物质将比其他工艺方法含量更高。

1.6 凝聚法

凝聚法是按3个步骤进行包封的一种方法：制备乳液、微囊化包封和固化。表面活性剂，如吐温80，用于乳液制备。单宁酸、甘油或戊二醛可用于固化工艺。一些生物高聚物被用于包封、保护和释放亲脂性化合物，主要有大豆蛋白/阿拉伯树胶、明胶/阿拉伯树胶和明胶/果胶。凝聚法技术成本低廉，最适合用于油性化合物和精油的微囊化。

以复合凝聚法制备的波尔多树(Peumus boldus Mol.)精油微胶囊处理花生种子，在长达114 d贮存期内对青霉菌和曲霉菌具有极佳的防效。据报道，有人还用凝聚法包封芥菜精油，其物化性质稳定并具较强的抗菌作用。

1.7 分子包合法

分子包合物通常是特殊的化合物，其中一个组分的分子，称为客体分子(guest molecules)，被完全或部分地包在另一个组分即主体分子(host molecule)的空腔中。环糊精是最常用的主体分子，这些复合物的结构取决于其空腔的性质。

图2 海藻酸盐(alginate)和钙的三维网(“蛋盒模型”)

环糊精是淀粉在环糊精酶糖基转移酶作用下生成的环状寡糖。环糊精的外缘为亲水性，内腔为疏水性。因此，一旦有一个客体分子适合这个空腔，就会形成一个包合物。因此，有机分子和无机分子可以包封起来，从而改变客体分子的溶解性和稳定性。与环糊精分子包合的主要优点是增加了化合物在水中的溶解性，这是包封精油的一个理想特性。

近年来，环糊精分子包合物已被应用于包封防治植物病原物的活性化合物，尤其是真菌。丁香酚β-环糊精包合物微胶囊对荔枝霜疫霉菌(Peronophythora litchi)有较好的防治效果。丁香精油和牛至精油 β-环糊精微胶囊对尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的菌丝生长也有抑制作用。另一方面，苯丙素类化合物用环糊精包封时能更有效地抑制尖孢镰刀菌和灰霉病菌的生长。可用一些假设解释这一结果，比如真菌可利用包合物作为碳水化合物的来源，或者由真菌自身生成的壳体物也可自主抑制菌丝的生长。

2 主要的包封材料

2.1 海藻酸盐

海藻酸盐是甘露糖醛酸的线型共聚物，其 C-5差向异构体为古罗糖醛酸，分子式(C6H8O6)n。它存在于海藻和某些细菌中。该物质根据甘露糖醛(M)与古罗糖醛酸(G)的比例以及其序列结构和聚合度不同差别很大。因此，该物质可以呈现为M-G残基和由2个或2个以上M-G残基组成的嵌段(blocks)的交替序列。

海藻酸盐是一种可生物降解的聚合物，在Ca2+和Mg2+等二价阳离子存在时会形成三维凝胶。钙离子与海藻酸盐链中的古罗糖醛酸嵌段结合，形成一个三维网(图2)。这种特性使海藻酸盐成为包封生物活性化合物的理想材料，包括植物病理研究关注的化合物。

例如，海藻酸钠可用于从植物中提取的酚类化合物的制备，确保保留此类物质80%以上功效。用海藻酸钙微球包封植物提取物、精油和生防剂可延长活性化合物或拮抗微生物的有效性。

2.2 壳聚糖

壳聚糖是几丁质脱乙酰化所得的一种阳离子氨基多糖，是昆虫和甲壳类动物外骨骼中含量最高的部分。壳聚糖的结构由β (1-4)2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖(或 D-氨基葡萄糖)重复单元构成，分子式为(C6H11O4N)n。壳聚糖可用作多种包封方法的成分，如凝聚、乳液和挤压。当壳聚糖纳米凝胶(Chitosannanogels)在水中分散时具有生物相容性和稳定性，有利于纳米胶囊的处理。

肉桂粉和肉桂提取物与壳聚糖的混合物对立枯丝核菌和南方根结线虫(Meloidogyne incognita)具有一定的离体防治潜力，但还未在田间对此进行研究。在室内试验中，巴柑檬(Citrus bergamia)和酸橙(Citrus aurantium)精油壳聚糖胶囊可抑制黄曲霉(Aspergillus flavus)的生长。

2.3 乙酸纤维素

纤维素是地球上最丰富的天然高分子。由于纤维素的熔点较低，通常将其转化为其衍生物，使之更易于加工。乙酸纤维素(CA)、丙酸纤维素和丁酸纤维素等一些纤维素衍生热塑性酯类即是如此。

乙酸纤维素是木纤维与醋酐和乙酸反应生成的一种酯。这个反应在硫酸存在的条件下发生。产物随后被水解以除去酸、硫酸基和乙酸，直到获得所需的性质。乙酸纤维素粗纤维是由乙酸纤维素薄片物理转化而来，即乙酸纤维素在丙酮中溶解，随后在粗纤维中膨胀。乙酸纤维素可以较大范围的取代度(DS)生成。但由于必须得到具有适当摩尔质量、熔化温度和适当溶解度的产品，最常见的是生产DS为2.5的乙酸纤维素。当DS＞2.5时，使用二氯甲烷作为溶剂。

乙酸纤维素膜可包含植物提取物和精油。根据膜的特性，可向乙酸纤维素中添加增塑剂，如邻苯二甲酸二辛酯(DOP)、柠檬酸三乙酯(TEC)和丙三醇。Pola等人(2016)开发了含牛至油和蒙脱石黏土精油的乙酸纤维素膜，用于防治采后病原菌链格孢菌(Alternaria alternata)和匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)。这些膜通过可直接接触和释放活性挥发性化合物发挥抗真菌作用。

2.4 淀粉

淀粉是以颗粒形式储存的植物贮存多糖。它价廉易得，来源广泛，如玉米、大米、木薯、小麦等。淀粉的结构单元为 α-D-(1,4)糖苷键连接的脱水葡萄糖。它由2个同聚物组分组成：直链淀粉(15%～30%)和支链淀粉(85%～70%)。在植物病理学研究中，淀粉基膜可用于获后水果贮藏，可能含有植物提取物、水杨酸和精油。

淀粉在薄膜生产中的应用，是基于直链淀粉形成凝胶的化学、物理和功能特性及其成膜的性能。由于其线性，溶液中的直链淀粉分子往往平行排列，从而在相邻聚合链的羟基间形成氢键。因此, 聚合物对水的亲和性降低了，这有利于形成不透明的糊状物和牢固的薄膜。直链淀粉在淀粉中占比高会形成更坚固、更有弹性的薄膜，由于支链淀粉的支链结构则一般形成机械性能较差的薄膜。

传统上，淀粉基膜是由浇铸法产生，因为天然形式的淀粉的熔点高于其分解温度。在这种方法中，将淀粉溶于溶剂中，所得成膜剂溶液(filmogenic solution)在干净平整的表面应用。溶液于 25～30 ℃放置蒸发溶剂。Dias (2010)报道了一种用浇铸法制备大米淀粉和米粉薄膜的技术。简而言之，生淀粉(raw starch)或面粉水溶液(质量体积比为5%)以4 000 rpm搅拌15 min。向水溶液中添加增塑剂(丙三醇或山梨醇)，浓度为0.20 g/g或0.30 g/g干生淀粉或面粉。随后，将混合物加热至85 ℃，期间连续搅拌1 h，均匀地倒在有机玻璃板上，置于鼓风烘箱中于30 ℃烘干 14 h。为制备米粉膜, 将水溶液的 pH 值调至10.0，以促进蛋白质溶解。

膜中添加增塑剂可提高其弹性、加工性和延展性。最常用的增塑剂是丙三醇和山梨醇。丙三醇是一种具易与淀粉链相互作用的羟基基团的亲水性小分子。当希望降低淀粉膜的亲水性时，脂肪酸和精油也可用作增塑剂。

淀粉膜在具有效水的环境中可迅速生物降解。在共混物中加入其他更稳定的组分能延缓淀粉膜的降解。淀粉共混物可以用壳聚糖、聚乳酸(PLA)生产；聚对苯二甲酸丁二醇酯-己二酸丁二醇酯共聚物(PBAT)和聚丁二酸丁二醇-己二酸丁二醇酯共聚物(PBSA)。

2.5 聚己内酯和聚对苯二甲酸丁二醇酯-己二酸丁二醇酯共聚物

聚己内酯(PCL)是一种对活性化合物具有高渗透性的可生物降解的合成聚合物。PCL为半结晶聚合物，玻璃化转变温度为−60 ℃，熔点为59～64 ℃。PCL确保了制剂的稳定性，提高了耐应力开裂的能力，增强了缓释性。Lippia sidoides(一种富含百里香酚的植物)精油PCL纳米胶囊可在5 ℃下稳定保存60 d。可将丙酸纤维素、乙酸丁酸纤维素、聚乳酸和聚乳酸-羟基乙酸共聚物(polylactic acid-co-glycolic acid)与PCL混合，以改善制剂特性。

聚对苯二甲酸丁二醇酯-己二酸丁二醇酯共聚物是以丁烷-1,4-二醇、己二酸和对苯二甲酸为原料合成的一种共聚酯。虽然它来自石油，但它可在几个星期内完全生物降解。PBAT膜具有良好的加工性、高弹性、疏水性以及优异的机械和阻隔性。它比其他聚合物价格昂贵。但PBAT与低成本的生物聚合物的混合物可生产具有良好机械和阻隔性的价廉、可生物降解的膜。

3 结 语

植物合成了一系列可用于防治植物病原菌的化合物。由于许多国家植物物种的多样性，特别是位于热带和亚热带地区，若干对植物病原物有抑制作用的物质目前还尚未被人类发现。由于这些物质在田间试验中效果较差，许多前景看好的植物源物质的潜力被低估了。植物提取物和精油制剂可以减少生物活性化合物的损失，许多植物源产品可用作防治植物病害的替代药剂。在植物病理学的研究中，很少对植物源物质制剂的生物活性进行探讨。如上所述，可根据试验目的制备一些低成本的制剂，减少生物活性化合物的损失。要将有潜力的植物材料开发成商业化产品取决于多种因素，如操作工艺和经济状况。纳米材料和纳米技术为新颖植物源产品的开发提供了前所未有的可能性。因此，必须鼓励植物病理学家使用制备的植物源物质制剂，而不是它们的粗产物，这样可能会增加植物病害环境友好型防治方案数量。