作物保护中用RNA干扰技术防治节肢动物害虫、病原菌和线虫

叶 萱 编译

(上海市农药研究所，上海 200032)

1 发现和引入

在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中发现RNA沉默机制后，此技术就广为人知，但首次报道植物中的此现象是在1928年。在此报道中，Wingard介绍了烟草感染烟草环斑病毒后的症状情况，只有较低位置的叶片坏死了，上面的叶片对病毒有免疫作用而无症状。在当时还不知RNA沉默机制，但此例说明植物具有防御病毒作用，这可能是原始真核生物的最初功能之一。后来，在另一重要文章中，Napoli和其同事报道矮牵牛植物中查尔酮合酶的过度表达使植物开的花为杂色，而不是预期的深紫色。那时此现象被称为“翻译后基因沉默(post-translational gene silencing)”，现在被认为是RNA干扰(RNAi)研究的早期成功事例之一。在其他包括真菌的数个真核生物中也发现了相似的现象，被称为“抑制(quelling)”。Fire和Mello对秀丽隐杆线虫的研究发现了以上所有的现象，称为“RNA干扰”。此被认为是近 20年中最重要的科学突破之一，由于 Fire和Mello发现了真核生物的RNAi机制，在2006年他们共同被授予诺贝尔生理学或医学奖。此发现最后导致生物学研究中新学科的诞生，即研究非编码RNA(ncRNA)，也就是没有被转化为蛋白质的RNA分子。此机制的阐明对了解基因调控、基因功能和抗病毒防御作用有极大的作用。

从害物防治的观点看，ncRNA引发了RNAi机制，导致基因沉默，通过破坏相应的信使 RNA(mRNA)阻碍重要靶标基因的表达。与传统神经毒性杀虫剂等害物防治策略相比，RNAi技术具有高度的特异性，可用于基因研究和农业，如保护有益昆虫免受病毒和寄生物危害，抗性管理和防治许多作物免受害虫、植物病原菌、螨、蜱虫危害等(图1)。

RNAi技术产品能提供新的补充的害物防治解决方法，其效果和选择性远高于化学农药等传统方法。预期基于RNAi的生物农药以转化产品(整合于植物的保护剂，PIPs)和非转化产品/非 PIP产品(喷雾、茎秆注射、灌根、种子处理或粉剂/颗粒产品)上市。市场对双链RNAs (dsRNAs)不断增长的兴趣已促使开发出更好的生产系统，更有效的制剂，成本也从2008年的每克12 500美元下降到现在约2美元(2017年9月)。虽然仍缺乏田间试验，但预测dsRNA的使用量约为2～10 g/hm2。此用量可能因靶标害物对RNAi的敏感性，对RNAi的内吸性和制剂的传递性不同而变化。此产品对作物的保护和对环境的风险应处于平衡，考虑到 RNAi具有独特作用机制，可能也沉默未预期的基因，故使用一定方法全面评估基于RNAi的农药和工程化作物的潜在风险。

应用农业生物技术已开发了一些 RNAi产品。本文旨在为新颖保护作物RNAi产品开发机会，讨论了它们防治植物病原菌、线虫、螨、植物病害和影响有益昆虫的病原菌的潜力。此外，讨论了RNAi技术的环境影响和经济成本，也提出转化基础RNAi研究为新颖实际应用的方式。

2 何为RNAi以及如何起作用

RNAi是大多数真核细胞中通过mRNA降解、抑制翻译和染色质重塑来调节基因表达的古老机制。其启动子为具有2个补充链的 RNA分子，即dsRNA，属于ncRNAs类型(图1)。约21-25 bp dsRNA分子具有约2-nt 3´突出端(overhang)，能够被RNAi机器的酶识别，随后靶标mRNA进行同源依赖性降解。在RNAi途径中有2个重要类别RNA：microRNA(miRNA)和小干扰 RNA (siRNA)。除了这些典型miRNA和 siRNA，持续发现其他类别的 RNA，表明这些RNA参与的途径和调控机制的多样性。本文将集中介绍miRNAs和siRNA。

图1 作为一系列保护作物，改善作物，改良蜜蜂健康和抗性抑制的工具的RNA干扰(RNAi)技术

miRNA主要为生物内生，在细胞中由茎环前体和不完全双链配对产生。相反，siRNA为外源物，从病毒、转座子或转基因衍生而来的长而完全互补的dsRNA生成。为了简单阐述siRNA和miRNA的分子机制，它们最初都由 dsRNA经核糖核酸Ⅲ酶Dicer加工为20-30-nt双链而产生。之后，有催化作用的Argonaute家族蛋白(AGO)被纳入RNA诱导的沉默复合体(RISC)中。RISC既介导 mRNA的降解又抑制翻译。在大多数真核生物中，除昆虫和脊椎动物外，主要dsRNA启动子通过RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)的作用诱导次级siRNA的合成，此现象为过渡性 RNAi(transitive RNAi)。这些次级siRNAs以不是最初dsRNA分子的靶标的mRNA区域为靶标，潜在地沉默多个转录。在昆虫和脊椎动物，还没有发现相似的基于 RdRP的扩增系统，因此过渡性 RNAi的缺乏可能增加特异性，而以单个替代性剪接mRNA同源体为靶标。这3类分子，即Dicer、Argonaute和RNA的20-30-nt双链，被称为基因RNA沉默的必要要素，已有文章进行详尽介绍。

重要的是，RNAi有2个相关方面因生物种类不同变化很大。第一为沉默效应的持效期，第二为系统性RNAi性能。由dsRNA扩增产生的次级siRNA能够产生长时间强而持续的反应。此外，RNAi的系统特性也就是RNAi信号/作用在细胞间和组织间的扩展，能够导致 RNAi效应的可遗传性传递(亲本RNAi，parental RNAi)。当dsRNA到达生殖细胞，沉默信号传递到下一代的胚胎就会发生亲本RNAi。

根据生物的需要可在任何时候启动miRNA和siRNA沉默。因此，内源基因的表达方式的变化与生物所处的环境有关，受新miRNAs表达的调控。相似地，当基因组面临入侵者(例如病毒)核酸的威胁时，就以siRNA机制降解这些核酸，以免受威胁。

RNAi能特异性抑制任何基因的表达。因为21-25-bp dsRNA可被设计为独特的，只能沉默既定靶标基因。因此，其在农业中有广泛的应用，可保护蜜蜂免受病毒和寄生物的危害，可作为新颖的高度特异性的害物防治策略。

3 RNAi用于害物管理

自从发现RNAi以及其调节潜力后，它为害物防治打开了一扇新的大门。科学家已利用RNAi关闭基因，开发出与已有所有商业化产品不同的具有独特作用机制的产品。

此愿景方法的目的是开发 RNAi机制来获得一系列害物防治的工具，以及以重要基因为靶标，利用此机制抑制农药抗性的发展(图 1)。例如，“BioDirect”产品利用 RNAi进行害虫和病毒的防治，对蜜蜂的安全性高，和化学除草剂合并对杂草的防效高。这些项目目前还处于于研究和开发的第一和第二阶段。

田间应用RNAi可能包括传统的PIPs (即转基因植物/基于RNAi植物形状)，以dsRNA为活性成分，应用可变的传递方式的杀虫剂、杀菌剂、杀螨剂和抗病毒制剂产品(第4节)。此外，这些dsRNA能被用于抑制昆虫和杂草的抗性产生。对于此第二类别的非PIPs，含dsRNA的终端产品(dsRNA-EPs)可能以4种类别上市：⑴ 防治剂；⑵ 抗性因子抑制剂；⑶ 发育干扰剂；⑷ 生长促进剂。本文中仅讨论与作物保护有关产品的发展。

笔者认为开发高度量身定做的保护作物和促进作物发育的 RNAi产品的潜力部分由靶标生物高度变化的响应性决定。因此，以下讨论诱导昆虫、真菌、其他植物病原菌、线虫和螨中RNAi和使用RNAi产品为抗性因子抑制剂进行昆虫和杂草的管理的例子，这可被进一步开发用于农业产品。

3.1 节肢动物

RNAi对一些昆虫特别有效，特别是鞘翅目昆虫，作用快。可惜的是鳞翅目和半翅目害虫对外部RNAi的对抗性很强，表明具有生物屏障限制RNAi用于管理这些昆虫。阐明这些瓶颈可能使具有独特性和新颖作用机制的此技术用于综合害物管理(IPM)策略。

Baum等人撰写的里程碑性文章表明在转基因玉米中的dsRNA能导致玉米根虫(WCR, Diabrotica virgifera)幼虫死亡。此研究使研究人员意识到daRNA具有通过转基因作物作为新的害物防治剂的潜力。在2016年9月，加拿大食品检验局批准新玉米品种MON87411的商业化，其商品名为SmartStax PRO，表达了3个Crystal (Cry)基因和含有玉米根虫蔗糖非发酵7(DvSnf7)基因的240-bp片段的dsRNA。在2017年6月，美国环保局也批准此玉米商业化种植。DvSnf7基因编码液泡分选中的重要蛋白，到目前为止还没有开发出干扰这个过程的杀虫剂。然而，由于RNAi机制，Snf7 dsRNA单独需要很长时间来有效杀死玉米根虫。因此，MON87411合并了来自Bt (Bacillus thuringiensis)以主要鳞翅目害虫和WCR为靶标的作用更快的 Cry 基因以及叶甲(Diabrotica spp.)复合体。这些机制(即 Bt和 RNAi)联合的主要目标是降低昆虫对Bt技术抗性的产生。已研究表明转基因玉米中 Snf7 dsRNA的表达能够保护玉米根免受WCR幼虫的危害。

完全不同的应用路线是使用可喷雾dsRNA，考虑到dsRNA在环境中预期的半衰期短，与化学农药相比是环境友好替代法。叶用的dsRNA分子在温室条件下至少稳定 28 d可防治马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)，一旦在叶子上干燥了，dsRNA就不可浸出。已开发在柑橘叶上喷雾使用dsRNA防治柑橘象鼻虫(Diaprepes abbreviates)的RNAi策略，此方法具有防治这些叮咬/咀嚼害虫的前景。喷雾 dsRNA的效果令人鼓舞，但有几个方面还需要改进，预期含有dsRNA的终端产品在2019年上市。

喷雾 dsRNA可能防治取食植物的咀嚼害虫非常有效，但对半翅目等刺吸式害虫不是理想的方法。对于此类害虫，开发了植物系统(in plant system，iPS)方法，即用植物新芽(vegetative new growth flushes)传递dsRNA来防治柑橘木虱(Diaphorina citri)。使用此方法，当给柑橘木虱饲喂以精胺酸激酶为靶标的 dsRNA(即以对无脊椎动物的细胞能量和代谢有重要作用的基因为靶标)发生转录敲除和木虱死亡。

二斑叶螨(Tetranychus urticae)等螨是花卉植物和经济作物的重要害虫。由于大量使用农药，二斑叶螨迅速对几乎所有类型的杀螨剂产生了抗性。二斑叶螨基因组的获得有助于了解其转录后基因沉默机制，这为使用RNAi防治螨铺平了道路。以上描述的系统/亲本RNAi被用于抑制Distal-less基因的表达，此基因是参与附肢形成的同源异形基因一员，例如肢体形态的形成。给成雌虫注射 dsRNA或siRNA，就会产生缩短的和少腿的后代。建立了叶碟饲喂传递dsRNA的方法。用此方法沉默运输生物合成膜的外被体蛋白亚基 β-2基因，导致二斑叶螨的死亡率最高(＞65%)。因此，此方法可被用于迅速筛选致死基因。柑橘全爪螨(Panonychus citri)是柑橘的重要害虫，对大多数农药有抗性，RNAi能有效防治此种害虫。若虫取食dsRNA处理的叶碟后Spook基因被沉默，56%若虫死亡。这些结果表明以选择基因为靶标的dsRNA被取食后能够诱导基因敲除和螨死亡。因此这些靶标基因是开发为和Bt毒素和杀螨剂等其他防治策略联用的螨防治策略的候选物。

当然，新防治策略引入后其害虫抗性是人们常关注的问题。已知昆虫具有很大的表型和遗传可塑性，一些玉米根虫个体对玉米 MON87411中的DvSnf7 dsRNA性状较敏感或敏感性差。选用田间收集的对作物轮作有和无抗性的种群进行试验，试验表明昆虫对摄取的dsRNA有不同的反应。这表明不同玉米根虫种群对 RNAi农药的表型反应不同，证实 RNAi具有抗性发展潜力。综合害物管理原则可延缓抗性的产生。在美国环保局联邦杀虫剂、杀菌剂和杀鼠剂法案会议上讨论的对转基因 RNAi作物的可能抗性机制如下：⑴ dsRNA靶标序列240 bp被认为可发生变化，如DvSnf7 dsRNA，但较短的靶标也可能发生变化，单核苷酸多态性的出现可能降低dsRNA和其靶标的互补性。长的dsRNAs(＞200 nt)能够导致较大量的siRNAs与靶标mRNA匹配，而可能具有优势，能增加RNAi反应，阻止选择基因变化的个体。⑵ 对吸收、运输等重要的天然屏障引起的dsRNA动力学变化。⑶ siRNA分子的RIS复合体的识别的下降，RISC复合体降解靶标 mRNA的功能障碍，Dicer核糖核酸酶加工过程的减少或阻碍RNAi信号系统扩展等RNAi机器酶或成分的变化。⑷ 昆虫可能发展不同的机制来补偿特异基因沉默，如增加转录率或上调与沉默基因有相同或相似功能的其他基因。⑸ 在昆虫取食转基因植物期间，由于嗅觉或味觉变化导致对dsRNA吸收的减少，对食物中dsRNA产生抗性。然而，就以上参数而论，SmartStax PRO玉米与非转基因品系没有差异。在美国环保局联邦杀虫剂、杀菌剂、和杀鼠剂法案会议期间，一个报告表明用SmartStax PRO处理的盆栽作物中出现了约134个玉米根虫成虫，但没有证据表明这些个体对dsRNA DvSnf7产生抗性。以上提及的许多机制可能都是潜在的抗性机制，但到目前为止都没有被证实。采用传统的避难所，就是留有一定面积的没有以上性状的作物或不施用农药的作物，合用多个不同作用机制的杀虫剂以及不同防治策略能延缓昆虫对RNAi转基因作物发展抗性。

3.2 真菌和其他植物病原菌

在大多数情况下，RNAi途径和其主要成分，例如Dicer、Argonaute和RdRP，出现于大多数真菌品种中，这表明大多数真菌也是RNAi的靶标。RNAi也可被开发来干扰许多种类病毒的复制，所以RNAi途径可用于防治病毒和真菌植物病害。

影响谷物作物的数种病害，例如镰刀菌属死体营养真菌引起的赤霉病(FHB)和苗立枯病(FSB)可用RNAi成功压制。例如Kock等人用含有dsRNA的培养基离体培养禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)，此 dsRNA与负责麦角甾醇生物合成的细胞色素P450基因CYP51A、CYP51B和CYP51C互补，结果为 dsRNA具有如唑类杀菌剂抑制病原菌生长和引起形态变化的作用。研究表明表达相同 dsRNA(CYP51)的转基因植物拟南芥和大麦对禾谷镰刀菌侵染有高的抗性。相似地，在dsRNA被应用的地区，以负责真菌麦角甾醇生物合成的 CYP3为靶标的dsRNA用于大麦叶面防治禾谷镰刀菌的侵染。dsRNA首先到达木质部等质外体，然后以未知的机制转移到共质体。

以前的工作表明引起植物灰霉病的真菌病原菌灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)的2个类Dicer(DCL1/2)核糖核酸内切酶被敲除后，其致病力基本丧失，生长停止。DCL1和DCL2参与小RNAs的生物合成，被认为是RNAi途径的主要成分。在最近的工作中，用能使单独 DNA结合在一起的重叠聚合酶链反应技术在转基因拟南芥中成功表达Bc-DCL1/2片段。相似地，用烟草脆裂病毒(TRV)与 Bc-DCL1/2序列的重组载体，通过病毒诱导基因沉默(VIGS)，在番茄植物中表达Bc-DCL1/2-sRNAs。在2种情况下，Bc-DCL片段只启动了灰葡萄孢菌中的RNAi机制，而不影响来自拟南芥或番茄植物的类 Dicer蛋白。这说明 RNAi由于具有序列特异性作用机制，对特定靶标有高的选择性。Bc-DCL基因的沉默减弱了灰葡萄孢菌的致病性，其生长减缓了，而表达以马铃薯晚疫病抗性基因为靶标的sRNA的对照植物发病严重。最后，应用离体合成的作用于灰葡萄孢菌中相同基因的dsRNA或sRNA于水果、蔬菜和花表面也抑制灰霉病。这表明dsRNA可被用于防治获后水果和蔬菜的病害。

菜豆金色花叶病毒(BGMV)被烟粉虱(Bemisia tabaci)传播，菜豆被感染后产生金色花叶。开发的RNAi转基因菜豆表达以可引起病毒侵染的AC1病毒基因为靶标的内含子发夹结构。具有高抗的转基因植物品系，大约95%植物在高压接种(每个植物有300多个带病毒的烟粉虱)后不被侵染。

相似地，以外壳蛋白基因为靶标的 RNAi已被用于寄主诱导的基因沉默，使番木瓜树和李树分别对番木瓜环斑病毒和李痘病毒有抗性。这些是RNAi如何被用于防治植物病害和如何可能在栽培和获后采用用于防治1个植物品种病害的RNAi防治其他作物的其他病害的例子。

3.3 线虫

已有资料介绍 RNAi对模式线虫秀丽隐杆线虫有作用，dsRNA被注射或取食后也可传递给下一代(亲本 RNAi)。

在农业中，根结线虫给全球数种植物造成大的损失，包括使植物生长不佳，根瘿形成，低的氮固定率，有时整个作物死亡。RNAi可被工程化对线虫有抗性。例如，以前发现摄入以16D 10 dsRNA为靶标的dsRNA(以决定线虫-寄主结合的基因为靶标)导致线虫感染性下降。随后，能产生以相同基因为靶标的dsRNA的转基因拟南芥对4种根结线虫[南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、爪哇根结线虫(Meloidogyne javanica)、花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)和正北方根结线虫(Meloidogyne hapla )]有抗性。这些结果表明与对照相比，16D 10 dsRNA转基因品系每克根中根结线虫卵的数量可减少93%。因此，此方法可被用于作物保护，开发转基因作物为防治策略，使寄主对此重要病原菌有抗性。使用也以16D10基因为靶标的含有42 bp(pART27-42)或271 bp (pART27-271)的茎序列(stem sequence)的基于发卡的沉默结构，可开发出对线虫有抗性的转基因葡萄，此转基因葡萄可导致南方根结线虫侵染的减少。防治寄生性根结线虫 RNAi也对其他根结线虫属靶标有效，如Phe-met-arg-phe(FMRF)类酰胺肽基因[编码FMRF类肽(flp)-14和-flp-18，分别调节神经和肌肉活性]，但也对其他属如短体线虫属和胞囊线虫属有效。所有这些例子说明工程化技术可使许多重要农业植物对多种根结线虫具有抗性。

3.4 RNAi防治有益昆虫的病害和寄生虫

除了具有压制重要害虫和植物病原菌的潜力外，RNAi方法可用于防治蜜蜂和其他有益昆虫的病毒病。RNAi的天然功能为保护细胞免受病毒感染，故此方法合乎逻辑。研究表明蜜蜂取食相对应于IAPV基因组的2个不同序列的dsRNA可免受以色列急性麻痹病毒(Israeli acute paralysis virus, IAPV)感染。故为了保护蜜蜂不被IAPV感染，dsRNA产品“Remebee”被用于大规模田间试验。分别设置IAPV+Remebee、IAPV、Remebee和未处理对照，Remebee以饲喂进行处理。在不同的气候和季节，在美国2个州(佛罗里达和宾夕法尼亚州)160个蜂箱进行试验。结果为IAPV+Remebee处理蜜蜂的存活率增加了，蜜蜂的量和蜂蜜的量分别为 IAPA处理的2和3倍。相似地，给大黄蜂注射和饲喂病毒特异性dsRNAs，诱导IAPV特异性基因沉默和保护工蜂不被感染死亡。

RNAi也已被开发以狄氏瓦螨(Varroa destructor)等寄生虫和东方蜜蜂微孢子虫(Nosema Ceranae)等内微孢子虫寄生虫为靶标，防治蜜蜂成虫广泛发生的孢子虫病，用于提高蜜蜂的健康水平。这些寄生虫具有完全的RNAi作用机制，摄入dsRNAs后很容易被诱导产生RNAi。因此，把作用于东方蜜蜂微孢子虫能量代谢基因(ADP/ATP转运者)的dsRNA饲喂于被感染的蜜蜂，寄生虫的负载量会减少。相似地，RNAi被用于防治以蜜蜂成虫和幼虫的血淋巴为食的专性寄生虫狄氏瓦螨。当蜜蜂被饲喂作用于细胞骨架组装、能量转移和转录(例如 α-微管蛋白和RNA聚合酶 III)的数个狄氏瓦螨基因的特异性dsRNA混合物，螨的侵染可减少50%。有趣的是，以上处理对蜜蜂无明显影响。由于养蜂者用有机磷等化学农药防治狄氏瓦螨，螨已对许多化学产品产生抗性，RNAi方法虽然防效低于化学农药但是是替代性防治策略。

3.5 压制昆虫和杂草抗性发展基因

随着抗农药的害虫和杂草的数量在快速增加，开发压制与除草剂和杀虫剂抗性发展有关基因的dsRNA产品(抗性抑制剂，non-PIPs)的兴趣也在不断增加，此产品可被用于扩展现有化学农药的寿命。以下将讨论以 RNAi为抗性抑制剂，通过沉默害虫和杂草的与抗性发展有关的基因，延缓抗性种群抗性的发展。

昆虫主要有3种机制来应对毒物：行为、物理和生化机制。一旦毒物进入生物体，在毒物到达靶点前，生物会增加代谢解毒功能，滞留或排泄毒物。而 RNAi压制与抗性发展有关基因的表达，能使害物恢复对特定毒物的敏感性。在1个研究中，RNAi被开发用于沉默P450酶(CYP6AE14)，此酶降低了棉铃虫(Helicoverpa armigera)对棉子酚的耐受性。棉子酚是植物产生保护自身免受害虫危害的数个化合物之一。然而，CYP6AE14在棉铃虫幼虫中肠中高度表达，棉铃虫就对有毒浓度的棉花代谢物棉子酚有耐受性。在棉铃虫中已确定 5个棉子酚诱导的CYP基因，这些基因使此害虫对溴氰菊酯有耐受性。在东亚飞蝗(Locusta migratoria)体内，RNAi沉默溴氰菊酯诱导的CYP基因CYP408B1和CYP409A1，此害虫再暴露于溴氰菊酯后死亡率增加(约 21%)，这表明这些基因与拟除虫菊酯杀虫剂的抗性有关。相似地，RNAi敲除了抗马拉硫磷飞蝗体内2个高度表达的羧酸酯酶(LmCarE9和LmCarE25)后，此飞蝗暴露于马拉硫磷的死亡率增加约34%。最近有文章综述了如何应用RNAi研究害虫的抗性以及管理抗性。

品牌技术“BioDirect”是利用合成的 cDNA，此cDNA与直接抑制杂草中5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)产生的RNA片段互补。对抗草甘膦杂草(例如通过EPSPS扩增而赋予抗性)，喷雾使用此产品和草甘膦后，草甘膦的效力恢复。

从作物保护观点来说，RNAi通过抑制酶的正常产生，可能有助于应对代谢抗性，和化学杀虫剂/除草剂合用，使杀虫剂/除草剂的防效恢复。RNAi缓减代谢抗性的程度将取决于几个因素：昆虫/杂草品种和传递方法。例如，大多数鞘翅目害虫对 RNAi非常敏感，因此dsRNA制剂可作为抗性抑制剂，而半翅目和鳞翅目昆虫对其敏感性较差，其效果较低。此方法的效果也取决于沉默代谢途径的主要基因和是否RNAi能有效沉默这些基因。沉默这些靶标基因并不总是可靠的，因为有些抗性并不是代谢所致且对大多数农药来说其抗性机制未知。笔者认为单基因抗性用RNAi机制易于解决，而用RNAi较难减缓多基因抗性。

4 daRNA传递

到目前为止在作物保护领域中受到最大关注的传递方法为产生害物特异性dsRNA的转基因作物。研究已表明转基因传递能成功保护数种作物免受特异害虫的危害。美国环保局最近登记了4个产品，这些产品含有名为“SmarStax PRO”的RNAI PIP，可用于防治WCR。SmartStax PRO中的基于RNAI的性状导致含有 WCR Snf7基因的 240-bp片段的dsRNA转录。昆虫取食MON87411后，此种植物中产生的dsRNA被WCR和与WCR密切相关的其他害虫的RNAi机器特异性识别，导致Snf7基因下调，WCR死亡。然而，在许多情况下，由于政治或立法原因或被考虑的作物在技术上难以转化为期望的，使用转基因作物并不现实。因此，代替性dsRNA传递路线已被提出，这不涉及植物的转化。

RNA可通过植物的微管系统移动。因此可叶用dsRNA或土壤应用根吸收来压制害物的侵染。植物体内 dsRNA传递作为非转基因传递方法已被报道能成功传递dsRNA到取食植物的靶标害虫。叶面喷雾、根喷淋或茎杆注射dsRNA可使整个柑橘和葡萄树受药。2个半翅目昆虫和1个取食木质部的叶蝉能通过取食用dsRNA处理的植物而吸收dsRNA。这表明植物根能吸收 dsRNA分子，茎杆注射后dsRNA通过植物的微管(木质部和韧皮部)传递。此发现为防治难防的取食根和刺吸式害虫带来了新的可能，特别对于植物转化需数年以及费用高的多年生作物(例如葡萄和柑橘树)。

特异性病原菌 dsRNA叶面用于植物进行害物抗性管理也可替代转基因 RNAi。然而，仅 dsRNA喷雾于植物不稳定，是其实际应用的一大挑战。最近研究表明把 dsRNA负载于专门设计的无毒可降解的层状双氢氧化物(LDH)纳米黏土片(“生物黏土”)可保护dsRNA。一旦dsRNA负载于LDH上就不会被雨水冲掉，被持续释放，即使在用后30 d在喷雾叶片上都能检测到。此外，1次喷雾负载于LDH上的dsRNA，可保护被喷雾和新长出的未喷雾叶片不受病毒危害的时间至少为20 d。这证实dsRNA可以迁移到植物未处理的部分。然而，局部应用dsRNA对靶标基因转录只有暂时的修饰作用，不会改变基因组。这意味着由于阳光、微生物和细胞中天然dsRNA加工机制的降解，需要多次重复使用dsRNA。然而，此创新传递方法把传递 RNAi进行人类疾病治疗的纳米技术转为用于作物保护的环保的可持续发展的易于应用的局部喷雾。

害物共生体能被工程化后传递 dsRNA到害物寄主。在共生体介导 RNAi中，共生体和其寄主间的关系被开发为持续产生dsRNA和诱导寄主中的RNAi。VIGS可被用于短暂沉默害虫或寄主植物的病原菌靶标基因。在 VIGS中，害物特异性 RNAi诱导者序列被引入无致病性工程化病毒中，把工程化病毒暴露于害物细胞，对害物靶标基因mRNA特异性的siRNA将被沉默。当昆虫或病原菌摄取被工程化病毒感染的植物时，它们的 VIGS可被诱导。烟草植物表达对咀嚼式昆虫烟草天蛾(Manduca sexta)特异性dsRNA的反义片段的植物病毒TRV，昆虫幼虫取食这些植物后，能特异性沉默3个中肠表达的MsCYP RNAs。除了把植物病毒用作昆虫特异性dsRNA传递介质，另一潜在VIGS方法为使用重组病毒，此重组病毒在寄主昆虫体内能够感染和复制。在感染后，工程化病毒穿过昆虫细胞扩展，启动RNAi，导致昆虫基因特异性siRNA产生，随后基因沉默。然而，此技术的应用需要确定在靶标害虫体内能够自发感染和复制的病毒，因为病毒基因组的复制和/或转录对启动RNAi重要 。传统使用病毒防治昆虫(例如防治毛虫的杆状病毒)依靠发现有毒的高致病力的病毒品系，主要为品种特异性的，然而，非致病病毒能被工程化表达特异性dsRNA/siRNAs和直接传递到昆虫种群。

田间使用dsRNA进行害物防治时，只有dsRNA为品种特异性和经济有效才可行。喷雾应用dsRNA依赖于开发经济有效方法大量生产 dsRNA和其制剂化。幸运的是生产dsRNA的费用在迅速下降。例如NTP合成法生产1 g dsRNA的费用从2008年的12 500美元到2016年的100美元到现在60美元。缺乏降解 dsRNA酶的大肠杆菌品系[HT115(DE3)]可被用于大量生产dsRNA。由于细菌能够大量表达产生dsRNA，故细菌产生的dsRNA农药可在任何时候喷雾用于作物。这可被认为是最经济有效的生产dsRNA的方法(1 g约4美元)，因为对于大多数国家来说细菌生产 dsRNA是可以负担得起的生产体系。最近，1个生物技术公司开发了名为“Apse RNA Containers(ARCs)”的技术，用细菌可大量生产胶囊化dsRNA，成本约为 2美元/g。质粒编码天然产生的衣壳等蛋白可与另一质粒编码的 daRNA序列和装配点一起转化。当细菌在培养中生长时，它们产生自己组装在细胞中RNA周围的蛋白质亚基，包括装配点序列。在纯化细菌后，得到的RNA在环境中稳定，能够喷雾使用。由于缺乏田间试验，每公顷需要的dsRNA的量和施用频率仍未知，但预测每公顷使用量约为2～10 g。根据害物品种对RNAi敏感性、系统性 RNAi和制剂传递效率的不同，此数值可能差异很大。市场对dsRNA兴趣的不断增加会促进开发更好的生产体系，更有效的制剂和更低的成本。

5 RNAi对环境可能的影响

RNAi是正在出现的技术，为开发新颖害物防治策略和转基因植物性状带来了新的机会。下一代RNAi产品将利用植物产生的dsRNA或喷雾于植物上的dsRNA使害物的基因表达被抑制。虽然如美国环保局和欧盟食品安全局(EU-EFSA)等大多数生物技术产品管理机构对于新引入的PIPs的生态风险评估有丰富的经验(数年的 Bt作物评估)，但由于dsRNA独特的作用机制，用相同评估方法可能不能评估dsRNA的生态风险或危险性。

RNAi的活性谱是基于序列的。这意味着当前缺乏许多现有生物的基因组数据，特别在 RNAi应用区域，这可能会阻碍对作物区域/农业生态系统中应用的RNAi技术的生态风险评估。虽然预期siRNA为独特的，因此只沉默既定靶标基因，但已报道siRNA沉默非靶标品种的基因。通过PIPs或非PIPs传递的RNAi农药的潜在风险可被分为脱靶(off-target)基因沉默、对非靶标生物基因沉默、RNAi机器的饱和和免疫刺激。

化学和微生物农药以及Bt作物的环境风险一般用分层法评估。此方法常依赖于已知环境暴露浓度对不同非靶标指示性生物(例如传粉昆虫、捕食者和寄生者)的最大风险剂量测定。这些害物防治技术的作用机制已被详细地介绍过，然而，siRNA可能会和非靶标生物的基因组进行脱靶结合。这可以预测毒性影响和设计对潜在暴露的大量生物的最大风险生测。虽然脱靶结合不是对靶标生物的关注，但如果非靶标生物充分暴露于喷雾的dsRNA或RNAi工程化植物，在非靶标生物体内的脱靶结合可能是RNAi的风险。此外，不同生物(靶标/非靶标)可能具有不同的RNAi机器，如使dsRNA穿过膜的受体、Dicer和 Argonaute。这些差异可在 RNAi机器的效率上看到。然而，这些酶如何作用和是否出现在非靶标生物体中的差异表明，以 1个害物为靶标的dsRNA如何在其他生物的RNAi途径中起作用。因为 RNAi是基于序列的，由此可推断出与靶标害物种系关系密切的非靶标生物受 RNAi方法影响的可能性较高。对以往所有RNAi技术性状进行全面评估是检测其风险的适宜方法。

siRNA对已知mRNA的特异性与它们序列同系性的最低水平有关，二者之间较好的序列同系性可导致对靶标mRNA的抑制。然而，抑制程度取决于选择的 mRNA，2个分子间大量序列差异不能排除对mRNA基因的沉默。这在抗玉米根虫的转基因玉米中发现，也报道此玉米对其他数种甲壳虫有作用。黄瓜十一星叶甲 (Diabrotica undecimpunctata)和马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)与玉米根虫的这些基因的序列同系性只有79%和83%，以玉米根虫v-ATPase A和E为靶标的dsRNA也对这2种害虫的存活率降低约40%和45%。dsRNA的加工不是发生在固定的约 21个核苷酸间隔。外来的dsRNA序列被识别后可被 Dicer在任一核苷酸位置剪切，产生由系统RNAi机器产生的siRNA进一步填充大小和序列的潜在重叠的许多siRNA。siRNA多样，故与不同mRNA靶标的siRNA/dsRNA有高度同源性的潜力，因此增加了脱靶标和非靶标效应。产生多个不同功能siRNA的dsRNA能抑制非靶标生物体中的基因，这已被证实。计算机方法表明当较长dsRNA序列(100-400 nt)被用于产生siRNA池，脱靶效应增加。这是因为dsRNA所固有的序列多样性随着其长度的增加而增加，导致更多样的siRNA序列池。相同研究进一步表明所使用的品种[智人(Homo sapiens)、秀丽隐杆线虫和粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)]随意产生的siRNA序列的 5%-80%能结合到 1个生物体中的非既定mRNA。如果dsRNA的长度与脱靶结合成正相关性，那么使用 siRNA(21-23 nt)能降低脱靶效应的可能性。一致大小的siRNA对靶标mRNA的特异性提高，但不排除对非靶标生物的脱靶效应。也发现 RNAi以一定的过剩进行作用。因此，能够产生以害物mRNA为靶标的siRNA或miRNA，而不是被Dicer剪切的 dsRNA的转基因植物是降低对非靶标潜在影响的策略。这也可降低沉默靶标基因的可能性。到目前为止，有证据显示大多数RNAi转基因植物产生的所有dsRNA被剪切为siRNA，除非转基因植物在叶绿体中产生dsRNA。

siRNA中，前12个碱基由靶标识别序列组成。这表明在碱基2-12区域的错配就会使siRNA对靶标mRNA的所有活性消失，此区域外的错配可以忍受。显然，必须以此区域为重点来选择 siRNA，生物信息学在确定选择序列的特异性方面有重要作用。虽然BLAST搜索容易、快速，但其不能够特异搜索位置2-12，考虑到含有21-24 nt的 dsRNA的context，BLAST也不能评判短的非连续区域的同源性。而Smith-Waterman算法能被用于以迭代方式分析特异性位置，进行最佳局部对比，这可被用于短的引导序列的同源性分析。考虑到潜在暴露于dsRNA PIP和喷雾的dsRNA中已知农业生态系统中或周围的生物多样性，生物信息学工具可用于确定潜在的脱靶和非靶标生物，但不应被用作对非既定影响的绝对预测工具。除了生物信息学，其他策略可能被用于降低 RNAi的潜在环境风险。例如，以O-甲基核糖基代替siRNA的种子序列的第二位置，进行化学修饰，降低但非消除脱标结合。已知有效的 RNAi所需的 dsRNA长度因昆虫品种不同而变化。因此，这些脱靶/非靶标影响虽不能阻碍 RNAi作为农药，但为了保护暴露的非靶标生物，必须对各个生物进行脱靶/非靶标影响研究。

6 结语和展望

近年，已看到昆虫、蠕虫、病原菌和杂草中RNAi沉默的多个功能作用，已开发应用于农业实践。然而，如果要实现田间广泛应用，需要解决多个问题。目前的挑战为确定可能应用的最大程度，以及如何从研究发现转化为田间应用。例如一个方法为开发微胶囊dsRNA，直接喷雾用于叶面防治毛虫和鞘翅目昆虫。此策略能增加dsRNA在环境中和被害虫吸收期间的稳定性。大量生产dsRNA(例如细菌、ARC、植物和合成生产)的经济有效的方法正在被开发，市场竞争将有助于降低成本。

dsRNA可被量身定做为作用于调节单个靶标品种或一组相关品种的基因表达的途径，不影响有益和其他非靶标品种。此高度特异性是 RNAi的独特特征，远超过目前市场上作物保护策略的特异性，这是其主要优势之一。在以后几年，作物保护者可能会首次拥有高特异性和环境安全的策略，可大规模和小面积应用，适宜用于有机和非有机种植，成本低，可用于管理害虫和植物病害。

确定靶标是 RNAi用于作物保护的重要一步。搜索在暴露于 dsRNA后导致害物死亡的靶标是困难的，特别是如果害物不是已建立的实验室生物/模式昆虫和/或如果没有得到有关害物的充足的基因组工具和资源。昆虫基因组学一直提供数量不断增长的序列数据，由此就可快速确定潜在的靶标。目前，(2017年9月4日)对280个主要为昆虫的脊椎动物基因组和1 000个真菌基因组的测序或已完成或在进行中，大部分基因组可在生物技术信息Entrez基因组计划数据库的国家中心(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse/)免费获取。虽然数据序列有用，但只有数据序列还不充足，因此主要采用主动数据挖掘、RNAi 筛选分析和功能丧失型基因的筛选。例如，FLIGHT (http://flight. icr.ac.uk/)和 DRSC(http://www.flyrnai.org/)是在线数据库，含有活体果蝇高通量筛选和离体 RNAi筛选数据。相似地，iBeetle-Base (http://ibeetle-base.unigoettingen.de)数据库可用于搜索对赤拟谷盗(Tribolium castaneum)进行大规模RNAi筛选(约5 000个基因)所得到的 RNAi表现型。使用此数据库可为作物保护科学家提供发现假定靶标的起点，然后必须以对靶标品种的研究以证实。对于还没有获得基因组的昆虫，RNA测序等其他技术是费用承担得起的筛选最佳RNAi靶标的方法。此外，把靶标缩小为一个单独品种或一组相关害物品种(例如毛虫或刺吸式昆虫)而对有益生物和传粉昆虫没有影响的能力也很有趣。软件LAST (http://last.cbrc.jp/)被设计比较大的序列数据库(例如整个昆虫基因组/转录物组)。因此，通过比较靶标和非靶标品种数据库，可能排除非靶标品种的直系同源的可能性。LAST发现基于多样性而不是固定长度(例如BLAST使用11-mers)的最初匹配，是比较较多序列与基因组间同源性较好的方法。笔者相信这些工具能有助于确定特异性和敏感靶标，设计作物保护RNAi技术。

如上面所指出，确定重要靶标基因非常重要，因此表达水平的细微或短暂变化对靶标品种有严重的影响。这对于避免主要是浓度依赖型脱靶效应也重要，如上面对环境影响一节中所讨论的。不考虑靶标生物的情况下，作物保护的RNAi策略需要持续供应RNA分子。转基因植物能容易持续产生需要的dsRNA。研究表明转基因植物发夹dsRNA能够表达，但对每个靶标品种并不实用，例如多年生植物(例如柑橘和咖啡)，可能需要数年来开发和商业化。目前，正在努力使用天然产生的昆虫或植物病毒/细菌来开发共生体介导的RNAi方法。通过引入dsRNA结构到致病力减弱或无致病力的病毒基因组中来获得。对于昆虫来说，共生体中肠细菌能有效引起寄主体内的 RNAi。当修饰的天然存在的病毒/细菌发生侵染，这将是RNAi启动分子的持续来源。