杜仲叶提取物对凡纳滨对虾生长、免疫酶 活性及肝胰腺组织的影响

李军涛　李金宝　冼健安　陈惠琴　张秀霞　郑佩华　鲁耀鹏　王冬梅

李军涛1，李金宝2，冼健安1，陈惠琴1，张秀霞1，郑佩华1，鲁耀鹏1，王冬梅1*

（1中国热带农业科学院 热带生物技术研究所，海口 571101；2山东龙昌动物保健品有限公司，山东 齐河 251100）

摘要：【目的】明確杜仲（Eucommia ulmoides）叶提取物在凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）饵料中的适宜添加量，为研发高效、无污染、无残留的对虾饵料配方提供参考依据。【方法】以凡纳滨对虾专用饵料为基础饵料，分别添加0.1、0.2、0.3、0.5和0.7 g/kg的杜仲叶提取物，进行为期6周的养殖试验，探究饵料中梯度添加杜仲叶提取物对凡纳滨对虾生长性能、免疫相关酶活性及肝胰腺组织结构的影响。【结果】综合凡纳滨对虾的增重率、存活率和肥满度3个指标可知，添加0.3 g/kg杜仲叶提取物可有效改善凡纳滨对虾的生长性能和个体存活率，同时降低凡纳滨对虾的饵料系数；随杜仲叶提取物添加量的增加，凡纳滨对虾的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和酚氧化酶（PO）活性整体上呈先升高后降低的变化趋势，而丙二醛（MDA）水平的变化恰好相反，综合各项指标也是以0.3 g/kg添加量的效果最佳；梯度添加杜仲叶提取物对凡纳滨对虾肝胰腺无明显影响，仍保持完整的细胞结构，但其B细胞数量明显增多。【结论】饵料中添加杜仲叶提取物能有效提高凡纳滨对虾的生长性能和免疫酶活性，并增加肝胰腺中具分泌功能的消化酶细胞，具有替代抗生素的潜能，实际生产中的最适添加量为0.3 g/kg。

关键词： 凡纳滨对虾；杜仲叶提取物；生长性能；免疫相关酶活性；肝胰腺

中图分类号： S966.12； S963.739 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）09-1858-07

0 引言

【研究意义】凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）又名南美白对虾，是当前世界上养殖产量最高的三大优良品种之一（熊建华等，2011；姜松等，2018）。我国是凡纳滨对虾的主要养殖国，但一直存在虾苗易发病、养殖成功率低、缺乏高效功能型配合饵料等问题，致使生产上曾大量不规范使用抗生素，导致病原菌产生耐药性的同时给水产品质量安全带来极大隐患。我国经济正处在转型升级的关键时期，加上人民群众消费观念的转变，现已逐渐禁止在动物养殖过程中使用抗生素，因此寻求抗生素替代品成为养殖业的研究焦点，各类饲料添加剂也由化工型逐步转向中药型。【前人研究进展】杜仲（Eucommia ulmoides）是国家二级珍稀树种，名贵滋补药材，主要以皮入药，种质资源稀缺（冯风和梁志荣，1996）。杜仲皮一般需生长15—20年，而叶的资源相对丰富且易得，在发现其生理功能之前一直被视为废弃物。近年来，国内外专家对杜仲叶的成分（Leiss et al.，2009）及其药效（李竹等，2004）进行研究，发现杜仲叶提取物中富含绿原酸、多糖及黄酮等有益成分（李冉等，2016），与杜仲皮的成分类似。以杜仲叶代替杜仲皮的可行性已在临床、药理上得到验证（季春，2017），一致认为杜仲叶提取物作为饲料添加剂具有不产生耐药性、基本无毒副作用、资源丰富等特点，具有替代抗生素的潜能，即杜仲叶提取物是一种非常具有开发价值的中药饲料添加剂。在饲料中适量添加杜仲叶提取物对畜禽及鱼类的生产性能均有促进作用，具体表现为促进生长（吕武兴等，2005；胡忠泽等，2006；陈敬佳，2017）、增强非特异性免疫（王轶等，2015；段俊红等，2016）、提高抗应激能力（石英等，2008）和抗氧化能力（林建斌等，2015）、改善肉质等（孙文通，2017）。【本研究切入点】杜仲叶活性成分具有降血糖、降血脂、抗菌、抗病毒、提高免疫力、清除自由基、抗衰老等功能作用（李燕舞等，2017），但至今有关杜仲叶提取物对凡纳滨对虾生长性能、免疫功能及肝胰腺功能的影响鲜见研究报道。【拟解决的关键问题】探究基础饵料中梯度添加杜仲叶提取物对凡纳滨对虾生长性能、免疫相关酶活性及肝胰腺组织结构的影响，确定其在凡纳滨对虾饵料中的适宜添加量，为研发高效、无污染、无残留的对虾饵料配方提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

选择苗场健康的凡纳滨对虾虾苗培育至体长2.5 cm左右，随机分为6组，每组设3个重复，每个重复30尾虾，虾苗初始体重0.193±0.002 g/尾。杜仲叶提取物由山东龙昌动物保健品有限公司提供，凡纳滨对虾基础饵料购自广东海大集团股份有限公司。在基础饵料中分别添加0.1、0.2、0.3、0.5和0.7 g/kg的杜仲叶提取物作为试验饵料，配制前先将杜仲叶提取物充分溶解，采用梯度稀释的方法配制各试验饵料，制好的饵料自然风干，-20 ℃储存备用，饲喂前须将饵料解冻至室温。

1. 2 养殖管理

2017年5—7月在海南宝莱生物科技有限公司虾苗场进行为期6周的养殖试验。采用长×宽×高为50 cm×40 cm×40 cm的养殖箱进行养殖，水深25 cm左右，整个饲养期间保持水质稳定，水温28～33 ℃，溶氧量在6.0 mg/L以上，pH 7.8～8.5，氨氮0.02～0.04 mg/L，亚硝酸盐0.02～0.04 mg/L，盐度15‰～18‰。每天投喂4次饵料，日投饵量为虾总重的5%～8%，根据虾的摄食情况和水温进行适当调节。每次投喂后40 min利用虹吸管收集残饵，经烘箱70 ℃烘干后记录投喂量和残饵量。每2周称重1次，用以矫正投饵率。

1. 3 样品采集

养殖试验结束后禁食24 h，测定各组对虾体重，记录对虾尾数。每箱随机抽取6尾对虾，测量其体长和体重，抽取血淋巴，在冰盘上解剖分离肝胰脏和肠道并称重，-80 ℃保存备用。

1. 4 指标测定

1. 4. 1 生长性能指标

饵料系数=每缸投喂饲料总量/每缸对虾总增重量

肥满度（%）=体重/体长3×100

肝体比（%）=肝胰脏重/体重×100

增重率（%）=（终末虾体总重-初始虾体总重）/

初始虾体总重×100

存活率（%）=终末尾数/初始尾数×100

1. 4. 2 免疫相关酶活性指标 参照试剂盒（南京建成生物工程研究所）说明测定免疫相关酶活性。

1. 4. 3 肝胰腺组织切片制作 肝胰腺组织切片委托基尔顿生物科技（上海）有限公司制作。

1. 5 统计分析

试验数据以Excel 2010进行统计整理，利用SPSS 17.0进行单因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncans多重比较，并采用Origin 8.0制图。

2 结果与分析

2. 1 添加杜仲叶提取物对凡纳滨对虾生长性能的影响

由表1可知，对虾存活率随杜仲叶提取物添加量的增加呈先升后降的变化趋势，其中0.1、0.2和0.3 g/kg组的对虾存活率均显著高于未添加杜仲叶提取物的对照组（P<0.05，下同），并以0.3 g/kg组的对虾存活率最高，为94.44%。0.7 g/kg组的对虾增重率最低（496.49%），对应的饵料系数（1.940）显著高于其他试验组。随杜仲叶提取物添加量的增加，对虾肥满度也呈先升后降的变化趋势，其中0.2、0.3、0.5和0.7 g/kg组对虾的肥满度显著高于对照组。综合各项生长性能指标，发现杜仲叶提取物在基础饵料中的最适添加量为0.3 g/kg。

2. 2 添加杜仲叶提取物对凡纳滨对虾免疫相关酶活性的影响

2. 2. 1 对凡纳滨对虾超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响 饵料添加杜仲叶提取物对凡纳滨对虾肝胰腺和血清中SOD活性的影響如图1所示。无论是肝胰腺SOD活性还是血清SOD活性，对照组与各杜仲叶提取物添加组间的差异均不显著（P>0.05，下同）；血清SOD活性以0.3 g/kg组最高，肝胰腺SOD活性则以0.2 g/kg组最高。

2. 2. 2 对凡纳滨对虾丙二醛（MDA）水平的影响 饵料添加杜仲叶提取物对凡纳滨对虾肝胰腺和血清中MDA水平的影响如图2所示。在对虾血清中，0.1 g/kg组的MDA水平显著高于对照组和0.3 g/kg组，其他杜仲叶提取物添加组与对照组间差异不显著；在对虾肝胰腺中，0.7 g/kg组的MDA水平显著高于对照组和其他杜仲叶提取物添加组。

2. 2. 3 对凡纳滨对虾过氧化氢酶（CAT）活性的影响 饵料添加杜仲叶提取物对凡纳滨对虾肝胰腺和血清中CAT活性的影响如图3所示。对照组对虾的血清CAT活性显著低于0.1、0.2、0.3和0.5 g/kg组，但各杜仲叶提取物添加组间差异不显著，其中以0.2、0.3和0.5 g/kg组的CAT活性较高，分别为4.23、4.17和4.22 U/mg；在对虾肝胰腺中，对照组的CAT活性显著低于各杜仲叶提取物添加组，以0.2 g/kg组的CAT活性最高，达6.20 U/mg。

2. 2. 4 对凡纳滨对虾谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性的影响 饵料添加杜仲叶提取物对凡纳滨对虾肝胰腺和血清中GSH-Px活性的影响如图4所示。在对虾血清中，对照组与各杜仲叶提取物添加组间差异不显著，其中以0.2和0.3 g/kg组的杜仲叶提取物添加组较高，分别为66.43和66.38 U；在对虾肝胰腺中，0.3、0.5和0.7 g/kg组的GSH-Px活性显著高于对照组，其中又以0.7 g/kg组的最高，达56.34 U。

2. 2. 5 对凡纳滨对虾酚氧化酶（PO）活性的影响 饵料添加杜仲叶提取物对凡纳滨对虾血清PO活性的影响见图5。随杜仲叶提取物添加量的增加，对虾血清PO活性呈先增加后降低的变化趋势，以0.3 g/kg组的PO活性最高，达3.77 U/mg，显著高于对照组和0.7 g/kg组。

2. 3 饵料添加杜仲叶提取物对凡纳滨对虾肝胰腺组织结构的影响

由图6可看出，对照组与各杜仲叶提取物添加组对虾肝胰腺组织细胞均保持完整的细胞结构，未出现肝胰腺坏死症状，说明各试验组对虾的肝胰腺组织基本正常。R细胞：呈高柱状，细胞核位于近基部，呈圆形或椭圆形，有1～2个核仁，主要功能是吸收和储存能量。F细胞：呈高柱状，细胞核呈椭圆形或圆形，核仁明显，有1～3个核仁，其功能是吸收营养物质和合成蛋白质。B细胞：体积最大且形状不规则，胞质中含有1～2个大液泡，占细胞体积的80%～90%，主要功能是分泌消化酶及消化蛋白质。E细胞：细胞个体小，呈多边形，细胞核较大，呈圆形或椭圆形，有l～3个核仁，其生理功能是分裂和分化为其他类型的肝胰腺细胞。通过显微镜观察发现，0.2、0.3和0.5 g/kg组对虾肝胰腺组织中的B细胞数量明显多于对照组和0.1、0.7 g/kg组，说明这3组对虾的消化酶分泌量较多，与生长性能中的增重率变化趋势一致。其他几种细胞增加的数量不明显。

3 讨论

近年来，已有研究证实杜仲提取物或鲜杜仲可促进水生动物生长性能提高的物种有鲤鱼（Cyprinus carpio）（王华朗等，2003）、罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）（Liu et al.，2010）、凡纳滨对虾（刘波等，2013）和中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis H. Milne-Edwards）（季延滨等，2015）等。本研究结果表明，饵料中添加杜仲叶提取物对凡纳滨对虾增重率、存活率、肥满度的影响均呈先上升后下降的变化趋势，未表现出明显的量效关系，可能与杜仲叶本身的药用成分有关，达到最适添加剂量后继续增加反而产生负作用。综合这3个指标可知，添加0.3 g/kg杜仲叶提取物可有效改善凡纳滨对虾的生长性能和个体存活率。此外，在饵料中添加0.3 g/kg杜仲叶提取物能有效降低凡纳滨对虾的饵料系数，可能与杜仲本身具有保肝护胆的功效有关。相对于高等生物，凡纳滨对虾生理构造较简单，其肝胰腺既是解毒免疫器官又是消化器官，与凡纳滨对虾的生长及免疫密切相关。本研究初步确定杜仲叶提取物能有效提高凡纳滨对虾的生长性能，且以0.3 g/kg的添加量最优，但作为绿色无公害的保健型饵料添加剂还需进一步探究验证。

邱果等（2008）研究表明，对小鼠注射40 mg/kg的杜仲叶醇提取物可显著提高其巨噬细胞的吞噬能力及血清中的溶血素含量，进而提高其免疫力；王新军等（2013）按2.06 g/kg的剂量以杜仲提取物对运动大鼠进行灌胃，6周后大鼠肝脏的T-AOC、T-SOD、GSH-Px、CAT活性均显著高于对照组（灌胃生理盐水），即杜仲提取物可有效保护大鼠肝脏组织的抗氧化能力。在水产动物养殖中，杜仲提取物主要作为饲料添加剂使用。如在彭泽鲫（Carassius auratus var. pengze）饵料中添加1500 mg/kg杜仲提取物后其NBT阳性细胞、溶菌活力和抗菌活力较对照组明显升高（姚红梅，2005）；投喂添加杜仲提取物的饵料可有效提高斑节对虾（Penaeus monodon）抗白斑病毒的能力（Balaubramanian et al.，2008）；在草鱼（Ctenopharyngodon idellus）饵料中添加4%杜仲叶粉和0.10%、0.15%杜仲叶提取物均能极显著提高SOD活性（P<0.01）（冷向军等，2008）。本研究发现，随杜仲叶提取物添加量的增加，凡纳滨对虾的SOD、CAT、PO和GSH-Px活性整体上呈先升高后降低的变化趋势，而MDA水平恰好相反，综合各项指标以0.3 g/kg组的效果最佳，可能是杜仲叶提取物中含有的绿原酸、丁香脂素双糖苷、地普黄酮等有效成分具有杀菌抑菌和抗氧化作用，能消除动物体内过多的自由基，从而提高机体的非特异性免疫。

本研究以添加杜仲叶提取物的饵料投喂凡纳滨对虾，结果表明，对照组和各杜仲叶提取物添加组对虾肝胰腺组织细胞均保持完整的细胞结构，未出现肝胰腺坏死症状，能保证个体生长发育的需求。0.2、0.3和0.5 g/kg组对虾肝胰腺组织中的B细胞数量明显多于对照组和0.1、0.7 g/kg组。B细胞作为消化酶分泌的功能性细胞，其數量增加标志着添加杜仲叶提取物后对虾肝胰腺的消化吸收能力明显增强。但与免疫和分化相关的R细胞、F细胞、E细胞未出现明显的增加或减少，可能是生理状态处于正常或适宜条件下这些细胞未得到生态环境变化的足够刺激时无法显示出来。但在集约化的高密度养殖模式中，养殖环境通常随自然环境和养殖密度的改变而发生变化，因此对虾肝胰腺组织中R细胞、F细胞和E细胞的变化规律还需进一步试验探究。

4 结论

饵料中添加杜仲叶提取物能有效提高凡纳滨对虾的生长性能和免疫酶活性，并增加肝胰腺中具分泌功能的消化酶细胞，具有替代抗生素的潜能，实际生产中的最适添加量为0.3 g/kg。

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（責任编辑 兰宗宝）