复方苦玄参颗粒急性毒性和亚慢性毒性试验

邓鑫　陆彦蓉　覃兰迁　黄茂高

摘要：【目的】分析复方苦玄参颗粒对昆明小鼠的急性毒性作用和对Wistar大鼠的亚慢性毒性作用，评价其用药安全性，为复方苦玄参颗粒的兽医临床用药提供理论依据。【方法】急性毒性试验以SPF级昆明小鼠为研究对象，分3次灌胃，测定复方苦玄参颗粒对昆明小鼠的急性毒性作用。亚慢性毒性试验选取Wistar大鼠为研究对象，设高、中、低3个剂量组[13.40、6.70和3.35 g/kg（以复方颗粒计）]，每天灌胃给药1次，连续给药35 d，分别于第1、7、14、21、28和35 d称重，给药结束后对各剂量组Wistar大鼠（雌、雄各半）进行眼球采血，用于血常规指标和血清生化指标检测；同时采集肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、肠道、睾丸（♂）或子宫（♀）等器官称重，计算各器官的脏器系数，以及固定后制作石蜡切片，用于组织病理学检测。【结果】急性毒性试验结果表明，昆明小鼠在最大给药量（80.40 g/kg）下未表现出任何毒性反应，解剖也未发现明显可见的病理变化。亚慢性毒性试验结果显示，各剂量组Wistar大鼠的体重、血常规指标、血清生化指标和脏器系数与对照组（生理盐水灌胃）Wistar大鼠相比均未发生显著变化（P>0.05）；经剖检和组织病理学检查，发现高剂量组和对照组Wistar大鼠的脾脏、肺脏、肝脏、肾脏、胃、肠道、睾丸（♂）或子宫（♀）等器官组织均未出现异常病理变化。【结论】复方苦玄参颗粒无急性毒性作用，长期用药也不会产生亚慢性毒性作用，具有很高的用药安全性，可在兽医临床上推广应用。

关键词： 复方苦玄参颗粒；急性毒性；亚慢性毒性：用药安全性

中图分类号： S853.74 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）09-1873-07

0 引言

【研究意义】中药复方制剂是由两种或两种以上的中药材组方而成，含有多种有效成分，能直接杀灭或抑制病原及增强动物机体免疫力，且具有毒性低、不易产生副作用、多靶点、病原微生物对其不易产生耐药性等优点，在抗菌抗病毒的同时能促进动物生长（李艳华等，2008；王志敬等，2016；靳二辉等，2018）。中药复方制剂成分极其复杂，且多不明确，因此复方药物相互间产生的配伍效果需预先通过毒理学试验来检验其安全性，以减少或避免药物在临床运用时产生拮抗作用等不良反应，即中药复方制剂的安全性阐述和正确评价已成为当今新型中药开发及审核的关键环节。【前人研究进展】复方苦玄参颗粒是以广西道地药材苦玄参和桃金娘根为主要药味、按一定比例提取制备获得的中药复方颗粒剂。苦玄参（Picria felterrae Lour.）又名苦草，玄参科植物，味苦性寒，具有消肿止痛、清热解毒的功效，主要用于治疗咽喉肿痛、风热感冒、细菌性痢疾和毒蛇咬伤等（秦秀霞，2014）；桃金娘根是桃金娘的干燥根部，又名岗稔根、稔子根，具有理气止痛、利湿止泻、收敛、去瘀止血及益肾养血等功效（肖婷等，2013）。目前，针对苦玄参的药效已有大量研究报道，证实苦玄参具有镇痛（周芳等，2006）、抑菌（黄燕等，2008）、抗炎解热（李萍等，2007；吴建璋等，2012；陈君等，2013）、中枢抑制及心血管调节（邱灿华等，2008）等药效作用。其中，王奇志等（2010）研究发现，精制的苦玄参提取物对胃窦癌、胃癌、残骨癌等癌细胞均表现出细胞毒活性， 即具有一定的抗癌作用；吴建璋等（2012）研究表明，苦玄参干燥全草经水提和大孔树脂纯化所获得的提取物能抑制由二甲苯引导诱发的小鼠耳郭肿胀及腹腔毛细血管的通透性；陈君（2013）研究发现，以60%乙醇对苦玄参叶进行提取所得的提取物除了具有抗炎作用外，对小白鼠蛋清足跖肿胀也有抑制作用。在桃金娘的药效研究方面，Sepici-Dincel等（2007）以家兔为动物模型，经舌下注射桃金娘油后与正常家兔进行比较，结果证实桃金娘油具有明显的降血糖作用；Limsuwan和Voravuthikunchai（2008）研究发现，桃金娘叶提取物能强烈影响化脓性链球菌体内各种酶的重要代谢途径；陈旭和杜正彩（2010）研究表明桃金娘多糖对大鼠急性肝损伤有保护作用。【本研究切入点】根据新兽药临床前研究阶段要求，需使用实验动物开展相关安全性试验以考察产品开发的可行性。安全性试验一般包括急性毒性、长期毒性和特殊毒性研究，必要时需进行毒代动力学研究，以证明药物的安全性问题。复方苦玄参颗粒是本课题组以广西道地药材苦玄参和桃金娘根为主要药味、按一定比例提取制备获得，具有清热泻火、消炎止痢等功效（徐杨峰等，2018），但目前尚无有关復方苦玄参颗粒安全性评价的研究报道。【拟解决的关键问题】通过观察复方苦玄参颗粒对昆明小鼠的急性毒性作用和对Wistar大鼠的亚慢性毒性作用，评价其用药安全性，为复方苦玄参颗粒的兽医临床用药提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

8周龄SPF级昆明小鼠（动物合格证号XCXK桂2015-0001，体重20±2 g）和4周龄清洁级Wistar大鼠（动物合格证号XCXK桂2015-0002，体重80～120 g）均购自广西医科大学实验动物中心，雌雄各半，试验前在人工照明12 h、通风良好的条件下饲养观察7 d；灌胃前禁食12 h，但不限制饮水；试验期间饲喂大鼠全价鼠料，饲养环境为SPF实验动物房。复方苦玄参颗粒（批号20151113）由广西北斗星动物保健有限公司生产提供，每1.00 g复方颗粒相当于原生药1.80 g，其最大溶解度为5.36 g复方颗粒可溶解于8.0 mL无热原蒸馏水中，即每毫升中含0.67 g复方颗粒（相当于每毫升含1.21 g原生药）。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 急性毒性试验 预试验：取SPF级昆明小鼠12只，随机分为3组，每组4只，按高（0.8 mL/只）、中（0.4 mL/只）、低剂量（0.2 mL/只）一次性灌胃给药，对照组则以生理盐水灌胃（0.8 mL/只），结果发现即使在高剂量组也未能测出半数致死量（LD50），说明复方苦玄参颗粒毒性低，因此需采用24 h内多次给药的方法测定药物最大给药量，以评价复方苦玄参颗粒毒性。正式试验：采用最大耐受剂量法，选取SPF级昆明小鼠40只，禁食12 h后分为2组（给药组和对照组），每组20只，雌雄各半。称重后采取灌胃给药，24 h内分3次灌胃，间隔8 h，每次给药剂量均为最大耐受剂量26.80 g/kg（以复方颗粒计）；对照组每次灌胃生理盐水（0.4 mL/只），24 h内分2次灌胃。给药后持续观察30 min，在最后1次给药结束后2 h进行观察，此后每天定时对昆明小鼠进行观察，连续观察7 d，记录昆明小鼠的行为、精神状态和排泄情况等临床症状，若出现中毒症状则增加观察频率和时间，详细记录毒性反应出现和消失的时间、死亡时间等相关信息。试验期间保证昆明小鼠可自由采食和饮水，试验结束后将所有存活昆明小鼠处死，进行病理学检查，并按毒性分级标准评价实验动物的急性毒性反应。

1. 2. 2 亚慢性毒性试验 选取Wistar大鼠80只，随机分为4组，每组20只，雌雄各半，初始个体差异不超过平均体重的±20%。试验设3个给药剂量组，高剂量组按照最大灌胃量2.0 mL/100 g进行灌胃，中、低剂量组依次按照等比系数1∶2的剂量进行灌胃，即高、中、低剂量组分别为13.40、6.70和3.35 g/kg（以复方颗粒计）。另设对照组，按1.0 mL/100 g的剂量灌服生理盐水。试验期间，每天定时按剂量灌胃给药1次，观察记录各组Wistar大鼠的行为表现、中毒及死亡情况，记录其饮水量和采食量，并于第1、7、14、21、28、35 d分别称重。试验结束后，对所有Wistar大鼠进行眼球采血，每只大鼠的血样分成2份：一份以抗凝剂抗凝，用于血常规指标检测；另一份静置析出血清，用于检测血清生化指标。完成采血工作后，每组选取10只Wistar大鼠（雌雄各半）进行剖检，称取主要器官的重量，计算各器官的脏器系数；同时采集肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、肠道、睾丸（♂）或子宫（♀）等器官组织进行固定和制作石蜡切片，用于组织病理学检测。

1. 3 统计分析

所有试验数据采用SPSS 13.0进行统计处理，并以t检验分析各试验组与对照组的差异显著性。

2 结果与分析

2. 1 急性毒性试验结果

昆明小鼠24 h内灌胃给药3次，每次0.8 mL/只，结果发现即使在最大给药量2.4 mL/只[80.40 g/kg（以复方颗粒计）]下，昆明小鼠也未表现出任何毒性反应。经过7 d的连续观察后处死所有昆明小鼠，通过解剖未发现明显可见的病理变化。说明复方苦玄参颗粒对昆明小鼠无急性毒性作用，临床用药安全可靠。

2. 2 亚慢性毒性试验结果

2. 2. 1 复方苦玄参颗粒对Wistar大鼠日常状态和体重增长的影响 高、中、低剂量组及对照组的Wistar大鼠在35 d的给药期间，其活动、摄食、饮水和排泄粪便均表现正常，未出现中毒症状，也无死亡现象。由表1和表2可看出，雌、雄性Wistar大鼠的体重增长速率与对照组相比均无显著差异（P>0.05，下同），表明复方苦玄参颗粒对Wistar大鼠体重增长无明显影响。

2. 2. 2 复方苦玄参颗粒对Wistar大鼠血常规指标及血清生化指标的影响 由表3和表4可看出，至试验结束时，各剂量组Wistar大鼠血常规指标中的红细胞计数（Ec）、血红蛋白（Hb）、白细胞计数（Lc）、嗜碱性粒细胞（BL）、嗜酸性粒细胞（AL）、中性粒细胞（NL）、淋巴细胞（LM）和单核细胞（ML），以及血清生化指标中的谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、尿素氮（BUN）、血糖（Glu）、血清白蛋白（Alb）、总蛋白（TP）、总胆固醇（CHO）和甘油三酯（TG）与对照组Wistar大鼠相比差异均不显著，表明复方苦玄参颗粒对Wistar大鼠血常规指标及血清生化指标无明显影响。

2. 2. 3 复方苦玄参颗粒对Wistar大鼠脏器系数的影响 由表5和表6可看出，至试验结束时，各剂量组Wistar大鼠的脏器系数与对照组Wistar大鼠相比也无显著差异，表明复方苦玄参颗粒对Wistar大鼠的脏器无明显影响。

2. 2. 4 组织病理学检查结果 试验结束后剖检Wistar大鼠，经肉眼观察均未发现任何异常和可疑病变。采集复方苦玄参颗粒高剂量组和对照组Wistar大鼠的肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、肠道、睾丸（♂）或子宫（♀）等器官组织进行组织病理学检查。由图1可看出，高剂量组和对照组Wistar大鼠的脏器均未出现异常病理变化，表明复方苦玄参颗粒对Wistar大鼠脏器组织无损害作用。

3 讨论

苦玄参具有抗炎解热、镇痛、中枢抑制和抗肿瘤等作用，但其与桃金娘根配制复方颗粒的安全性评价至今尚无研究报道。中药颗粒剂的优点在于其保持了中药有效成分的稳定性，且在大规模生产、包装和保存上十分便利（何龙和姚尧，2010）。与传统中药汤剂相比，颗粒剂中添加的辅料可避免汤剂味苦而导致不宜口服的缺点，以保证中药有效成分能让机体快速吸收而发挥药效。此外，中药颗粒剂保留了原中药饮片的特征，并解决了冲剂、合剂和糖浆剂等不能随证加减的缺点（于开彬，2008）。中药复方制剂是否安全是进一步研究其药理毒理作用的基本保障，同时对评价新药是否具备研发价值具有重要意义（李海燕，2015）。因此，进行急性毒性和亚慢性毒性试验是评价复方苦玄参颗粒安全性的必要环节。中药复方制剂的急性毒性通常采用半数致死量（LD50）进行衡量（李玉平，2012），但大量研究发现传统中药的毒性一般很低，急性毒性试验通常无法按常规方法测定出LD50，为此本研究采用最大耐受剂量法进行急性毒性试验，即当用药剂量大于5000 mg/kg时未出现动物死亡，则表示未能测出LD50，可结束整个急性毒性试验。本研究中的急性毒性试验结果表明，昆明小鼠在最大给药剂量为80.40 g/kg（以复方颗粒计）的条件下（其最大给药量远超过5000 mg/kg）7 d内均未出现任何毒性反应和死亡现象，且进食、排便等活动正常，说明复方苦玄参颗粒对昆明小鼠无急性毒性作用。

亚慢性毒性试验是新兽药临床用药前安全性评价中不可缺少的环节，通过不同剂量的长期重復给药，观察不同剂量药物长期在动物体内可能发生的不良反应，从而判断药物对靶器官和受试动物的累积作用，并明确安全的可重复给药剂量值区间，为临床科学用药提供理论依据（洪伟鸣等，2013）。在本研究的亚慢性毒性试验中，Wistar大鼠连续以灌胃方式给药35 d，较一般采用的大鼠30 d喂养试验多5 d，以便更好地发现药物的亚慢性毒性作用。试验结果显示，复方苦玄参颗粒对Wistar大鼠无亚慢性毒性作用，具体表现为：（1）各剂量组Wistar大鼠的体重增长速率与对照组相比均无明显差异；（2）复方苦玄参颗粒对Wistar大鼠血常规指标及血清生化指标无明显影响；（3）各剂量组Wistar大鼠的脏器系数与对照组Wistar大鼠相比也无显著差异；（4）组织病理学检查结果显示高剂量组和对照组Wistar大鼠的脏器均未出现异常病理变化。复方苦玄参颗粒对Wistar大鼠虽无亚慢性毒性作用，但其兽医临床科学用药剂量仍需进一步研究确认。

4 结论

复方苦玄参颗粒无急性毒性作用，长期用药也不会产生亚慢性毒性作用，具有很高的用药安全性，可在兽医临床上推广应用。

参考文献：

陈君，甄汉深，韦建华. 2013. 苦玄参叶抗炎药理作用研究[J]. 海峡药学，25（2）：23-25. [Chen J，Zhen H S，Wei J H. 2013. Study on anti-inflammation of Picria feltarrae leaves[J]. Strait Pharmaceutical Journal，25（2）：23-25.]

陈旭，杜正彩. 2010. 桃金娘多糖对大鼠急性肝损伤保护作用的研究[J]. 安徽农业科学，38（11）：5644. [Chen X，Du Z C. 2010. Protective effect of myrtle polysaccharide on acute liver injury in rats[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences，38（11）：5644.]

何龙，姚尧. 2013. 中药颗粒剂的研究现状及应用前景分析[J]. 中国当代医药，17（9）：82-83. [He L，Yao Y. 2013. Research status and application prospect of traditional Chinese medicine granules[J]. China Modern Medicine，17（9）：82-83.]

洪伟鸣，左伟勇，宋亮，黄文强，郁杰. 2013. 鸡支康口服液的亚慢性毒性试验研究[J]. 中国畜牧兽医，40（9）：140-143. [Hong W M，Zuo W Y，Song L，Huang W Q，Yu J. 2013. Study on subchronic toxicity test of Jizhikang oral liquid[J]. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine，40（9）：140-143.]

黄燕，肖艳芬，甄汉深，陈君. 2008. 苦玄参体外抗菌作用的实验研究[J]. 广西中医药，31（1）：46-47. [Huang Y，Xiao Y F，Zhen H S，Chen J. 2008. Experimental study of in vitro antibacterial activity of bitter Scrophulariaceae[J]. Guangxi Journal of Traditional Chinese Medicine，31（1）：46-47.]

靳二輝，周先建，孙启，周金星，李升和，金光明. 2018. 复方中草药制剂对肉鸡肌肉发育和肉品质的影响[J]. 江苏农业学报，34（2）：374-384. [Jin E H，Zhou X J，Sun Q，Zhou J X，Li S H，Jin G M. 2018. The effect of compound Chinese herbal preparation on muscle development and meat quality of broiler[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，34（2）：374-384.]

李海燕. 2015. 三参滋胃颗粒的稳定性及作用机制研究[D]. 长春：吉林大学. [Li H Y. 2015. The feasibility and the mechanism of Sanshenziweikeli in treating chronic atrophic gastritis[D]. Changchun：Jinlin University.]

李萍，周芳，陈勇. 2007. 苦玄参提取物解热作用的实验研究[J]. 时珍国医国药，18（11）：2638. [Li P，Zhou F，Chen Y. 2007. Study on the antipyretic effects of Picria felterrae Lour.[J]. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research，18（11）：2638.]

李艳华，闫清波，于康震，佟恒敏，孙元. 2008. 复方中药对禽流感病毒的防治研究[J]. 中国农业科学，41（5）：1511-1518. [Li Y H，Yan Q B，Yu K Z，Tong H M，Sun Y. 2008. Study of the compound Chinese medicine against the anti-avian influenza virus[J]. Scientia Agricultura Sinica，41（5）：1511-1518.]

李玉平. 2012. 清肺平喘颗粒的临床前研究[D]. 重庆：西南大学. [Li Y P. 2012. Preclinical study on Qingfei Ping-chuan granules[D]. Chongqing：Southwest University.]

秦秀霞. 2014. 苦玄参药理研究进展[J]. 亚太传统医药，10（2）：41-42. [Qin X X. 2014. Research progress on pharmacology of Picria felterrae Lour.[J]. Asia-Pacific Traditional Medicine，10（2）：41-42.]

邱灿华，陈健文，李晓君，蓝秀健，余剑平，林明栋. 2008. 苦参提取物对大鼠胸主动脉环张力的影响及其机制探讨[J]. 深圳中西医结合杂志，18（1）：4-6. [Qiu C H，Chen J W，Li X J，Lan X J，Yu J P，Lin M D. 2008. Effects of sophora extract on the tension of thoracic aorta in rats and its mechanism[J]. Shenzhen Journal of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，18（1）：4-6.]

王奇志，陈雨，王鸣，冯煦. 2010. 苦草提取物Pft-d对小鼠S180肉瘤、肝癌Heps 的抗癌作用及体外细胞毒活性实验研究[J]. 现代药物与临床，25（2）：134-137. [Wang Q Z，Chen Y，Wang M，Feng X. 2010. Study on antitumor activities of extracts Pft-d from Picria felterrae[J]. Drugs & Clinic，25（2）：134-137.]

王志敬，何翔，陈彩文，高振华，石琳. 2016. 中草药添加剂对AA肉鸡肌肉品质和风味物质含量的影响[J]. 河南农业科学，45（10）：146-150. [Wang Z J，He X，Chen C W，Gao Z H，Shi L. 2016. Effects of Chinese herbs on muscle quality and flavor compounds in AA broilers[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences，45（10）：146-150.]

吴建璋，文永新，黄永林，李典鹏，陈月圆. 2012. 苦玄参提取物对小鼠的抗炎及镇痛作用[J]. 中国医院药学杂志，32（16）：1303-1304. [Wu J Z，Wen Y X，Huang Y L，Li D P，Chen Y Y. 2012. The anti-inflammatory and analgesic effect of the extract of sophora japonicus in mice[J]. Chinese Journal of Hospital Pharmacy，32（16）：1303-1304.]

肖婷，崔炯谟，李倩，赵余庆. 2013. 桃金娘的化学成分、药理作用和临床应用研究进展[J]. 现代药物与临床，28（5）：800-805. [Xiao T，Cui J M，Li Q，Zhao Y Q. 2013. Research progress on chemical constituents，pharmacology and clinical application of Rhodomyrtus tomentosa[J]. Drugs & Clinic，28（5）：800-805.]

徐杨峰，聂海英，唐廷崇，彭健波，陶卿，何家康. 2018. 复方苦玄参颗粒质量标准初步研究[J]. 动物医学进展，39（8）：59-63. [Xu Y F，Nie H Y，Tang T C，Peng J B，Tao Q，He J K. 2018. Study on quality standard of Compound Kuxuanshen Granul[J]. Progress in Veterinary Medicine，39（8）：59-63.]

于开彬. 2008. 浅析中药配方颗粒的优势与不足[J]. 内蒙古中医药，（7）：31. [Yu K B. 2008. A brief analysis of the advantages and disadvantages of Chinese medicine formula granules[J]. Nei Mongol Journal of Traditional Chinese Medicine，（7）：31]

周芳，李萍，陈勇，陆孟引. 2006. 苦玄参干浸膏抗炎镇痛作用的实验研究[J]. 中国中医药科技，13（4）：244-245. [Zhou F，Li P，Chen Y，Lu M Y. 2006. Experimental study on anti-inflammatory and analgesic of Picria felterrae Lour.[J]. Chinese Journal of Traditional Medical Science and Technology，13（4）：244-245.]

Limsuwan S，Voravuthikunchai S P. 2008. Boesenbergia pandurata（Roxb.） Schltr.，Eleutherine americana Merr. and Rhodomyrtus tomentosa（Aiton） Hassk. as antibiofilm producing and antiquorum sensing in Streptococcus pyogenes[J]. FEMS Immunology and Medical Microbiology，53（3）：429-436.

Sepici-Dincel A，A?ikg?z S，Cevik C，Sengelen M，Ye?ilada E. 2007. Effects of in vivo antioxidant enzyme activities of myrtle oil in normoglycaemic and alloxan diabetic rabbits[J]. Journal of Ethnopharmacology，110（3）：498-503.

（責任编辑 兰宗宝）