一株猪丹毒杆菌分离株致病性与耐药性分析

2018-09-08王方珍山东省诸城市畜牧兽医管理局262200

中国畜禽种业 2018年7期

王方珍（山东省诸城市畜牧兽医管理局 262200）

猪丹毒杆菌是一个可寄存于哺乳类动物，家禽和鱼群的历史悠久的病原，更甚于感染至人类。猪丹毒杆菌发生感染可导致猪急性或者亚急性败血症、皮肤坏死、心内膜炎等恶疾。近年来，我国及亚洲部分地区猪丹毒时有发生，给我们敲醒警钟，猪丹毒杆菌的毒性及耐药性或许发生变化。诸多学者担忧疫苗还能否有效抵抗猪丹毒的攻击。对临床发病猪进行鉴定、测试、分析，确定所分离细菌为猪丹毒杆菌，并以小鼠进行毒菌及疫苗抗力试验，目的是为了为猪丹毒的预防和治疗提供科学依据。

1 样本及方法

1.1 病原体及疫苗

某养猪场捐病猪（肝、心、肺等器官），猪丹毒杆菌疫。

1.2 分离纯化细菌

从病体各组织中提取无菌样本置于恒温中培养、观察。选取可疑菌种培养并储存。

1.3 菌株染色分离镜捡

提取菌种涂片、染色并观察。

1.4 试验对象

健康小鼠。

1.5 引物设计及PCR测试

（1）引物设计；（2）提取菌种DNA；（3）煮沸法制作DNA模板，选取多个菌落放置于100μl的ddH2O的EP管中；（4）PCR聚合酶链式反应。

1.6 药敏试验

抑菌圈直径<10mm不敏感 (耐药)，10～20mm中度敏感，>20mm高度敏感。

1.7 用小鼠进行致病性细菌试验

将菌株分离纯化再与5%犊牛血清的营养肉汤稀释，用麦氏标准比浊管估算活菌数。再取一定数量的小鼠进行试验；最后用Reed-Muench法计算小鼠的半数致死量 (LD50)；并对死亡小鼠进行剖检观察。

1.8 试验猪丹毒疫苗对小鼠的免疫保护作用

分别取两组小鼠进行免疫和攻毒试验，在一定时间内，对小鼠的体重、精神状态及死亡情况等进行记录、分析，结果见附图。

2 试验结论

（1）细菌的形状。在血琼脂平板培养24～48h后，出现纤细、针尖大小、露珠样、半透明、表面光滑、边缘整齐的白色小菌落，有α溶血现象；在含5%小牛血清的营养肉汤中培养20h后出现浑浊。分离菌株经革兰染色镜检，在新培养基中，细菌呈典型的革兰阳性、长短不一、有弯曲的杆菌，培养超过24h，细菌有长丝状。

（2）细菌16SrRNA基因的PCR扩增为猪丹毒杆菌。

（3）进行猪丹毒杆菌和猪丹毒疫苗株G410T的药敏试验。

（4）检测猪丹毒杆菌的耐药基因，分离猪丹毒杆菌存在氨基糖苷类耐药基因和四环素耐药基因。

（5）试验细菌的致病性。

（6）试验猪丹毒弱疫苗的免疫攻毒保护性。

3 结论

通过从发病猪组织中分离并纯化得到细菌，并通过验证细菌的经形态特征、染色特性及PCR鉴定，最终确定为猪丹毒杆菌。并通过小鼠的试验证明猪丹毒杆菌的致病性。

猪丹毒杆菌的出现一定会造成抗生素的使用，而其耐药性会影响细菌感染后的治疗。在猪丹毒杆菌的耐药基因检测显示，猪丹毒杆菌包括疫苗株中存在氨基糖苷类aacC2、四环素类耐药基因tetB，但没有检测到四环素耐药基因tetA。同时，猪丹毒杆菌对β-内酰胺类抗生素有严重的敏感性。所以，猪场暴发疫情后的治疗首选药应为β-内酰胺类抗生素。但在临床用药时药敏试验高敏的药物还不能完全达到预期效果。