miR-622在结肠癌组织中的表达水平与患者临床病理特征及其预后的关系分析

孔 雷 刘 彬 于 强 孔 营

（1曲阜市人民医院胃肠外科 山东曲阜 273100；2济宁市第一人民医院胃肠外科 山东济宁 272100）

结肠癌是常见的消化系统恶性的肿瘤之一，其发病率和死亡率呈逐年上升的趋势［1］，据研究报道，目前结肠癌患者5年生存率仍低于60%［2］，由于其早期诊断困难、疾病进展速度快，严重危害人民群众的身体健康。结肠癌的发生、发展是一个多因素、多阶段、多步骤参与的过程，侵袭及转移是其致死的主要原因，由于机制尚不完全明确，至今仍然缺少有效预测的分子标志物和靶向治疗靶点。因此探索结肠癌发生发展的分子生物学机制，寻找能够有效判断患者预后的分子标志物意义重大。

微小核糖核酸（miRNA）是一类长度在18～25个核苷酸的内源性、高度保守的单链非编码RNA，可以通过靶向结合目标靶基因mRNA的3’-UTR区，在转录后水平抑制靶基因的表达，从而发挥其生物学功能［3-4］。近年来研究证实miRNA在肿瘤的发生、发展、侵袭及转移等过程中起着重要的调控作用，并与肿瘤的预后关系密切［5-6］。miR-622是近年来新发现的肿瘤相关微小RNA家族重要成员之一，研究已经证实miR-622在多种恶性肿瘤中表达显著下调，被认为是抑癌基因［7-9］。但目前有关miR-622在结肠癌中的表达情况的研究甚少。本研究通过qRT-PCR检测结肠癌组织和癌旁组织中miR-622的表达情况，分析其与患者临床病理特征及预后的关系，进一步评估miR-622在结肠癌进程和预后判断中的价值，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 临床资料和组织标本 以2010年1月至2011年6月济宁市第一人民医院和曲阜市人民医院收治的110例结肠癌患者为研究对象，本研究经医院医学伦理委员会批准，患者知情同意并签署同意书。纳入标准：（1）患者行结肠癌根治手术治疗；（2）患者有完整的临床资料和术后随访资料。排除标准：（1）术前接受过放化疗或生物免疫治疗等任何抗肿瘤治疗；（2）合并有其他恶性肿瘤。收集患者手术切除的癌组织和癌旁正常组织 （距离肿瘤边缘至少5 cm）新鲜标本，组织标本在离体30 min内生理盐水清洗后置入液氮中，转入-80℃冰箱中保存备用。所取癌组织标本均术后经病理专家证实为结肠癌。研究对象中男70例，女40例；年龄39～77岁，平均年龄（55.1±3.1）岁；有淋巴结转移68例，无淋巴结转移42例；TNM分期按照AJCC第7版分期标准进行分期：Ⅰ～Ⅱ期42例，Ⅲ～Ⅳ期68例。患者依据术后病理分期，给予高危Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期患者标准XELOX或FOLFOX方案辅助化疗6个月。术后随访通过门诊、住院复查和电话等形式进行。总生存期是以手术日期为观察起始点至患者死亡或末次随访，其他原因的死亡和失访作为截尾数据处理，总生存期终点事件为肿瘤性死亡。无病生存期以手术日期为观察起始点，无病生存期终点事件为肿瘤复发。

1.2 主要试剂和仪器 Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，RNA逆转录试剂盒及Real-time PCR试剂盒均购自美国Promega公司，miR-622及内参U6引物由上海吉玛制药公司设计合成，LightCycle 96荧光定量PCR仪购自瑞士罗氏公司。

1.3 总RNA的提取和qRT-PCR 严格按照TRIzol试剂盒说明书操作提取总RNA，琼脂糖凝胶紫电泳进行RNA完整性检测，紫外分光光度计检测提取的RNA纯度和浓度，以A260 nm/A280 nm在1.8～2.1范围内的RNA作为合格标准用于后续实验，参照Real-time PCR逆转录试剂盒说明书将总RNA逆转录成cDNA。引物序列：miR-622上游引物 ：5’-CAACGAGTCCTAACAGTCTGCTGAG-3’，下游引物 5’-TATCCTTGAGGGTCCGAGGTATTC-3’； 内参 U6 上游引物：5’-CATTGGCTTCGGCAGCACATATAC-3’，下 游 引 物 5’ -CAGGCTTGAATTT-GCGTGTCATCC-3’。以 cDNA为模板，利用Real-time PCR及特异性引物进行实时荧光定量PCR反应，反应条件：预变性94℃，2 min；变性 94 ℃，20 s；退火 60 ℃，30 s，共扩增 40个循环，以U6为内参照计算miR-662的相对表达量，相对表达量数值采用2-△△Ct法计算。实验重复3次。

表1 miR-622的表达与结肠癌患者临床病理特征的关系（n）

1.4 统计学分析 应用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。计量资料以（）表示，比较采用t检验；计数资料采用（n）比较，比较采用χ2检验；生存分析采用Kaplan-Meier法，比较采用Log-rank检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 miR-622在结肠癌组织和癌旁正常组织中的表达情况 应用qRT-PCR对110例结肠癌组织和相对应的癌旁正常组织中miR-622的相对表达水平进行检测分析，miR-622在结肠癌组织和癌旁正常组织中的相对表达水平分别为 （0.41±0.12）与（1.05±0.06），与癌旁正常组织相比，结肠癌组织中miR-622的表达水平下调（t=50.031，P ＜ 0.001）。

2.2 miR-622的表达与结肠癌患者临床病理特征及预后的关系 以miR-622均值水平0.21为临界值，将患者分为miR-622高表达组（n=52）和低表达组（n=58）。结果显示，miR-622低表达者血管淋巴管浸润、淋巴结转移、III～IV期及远处转移的占比均高于高表达患者 （均P＜0.05），miR-622低表达者在性别、年龄、肿瘤大小、分化程度及浸润深度等方面的占比与高表达者比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。见表1。

2.3 不同miR-622表达水平的结肠癌患者预后为进一步了解miR-622表达水平与结肠癌患者预后的关系，使用Kaplan-Meier法对患者进行生存分析，结果显示miR-622低表达组患者的中位总生存时间为38.7个月，中位无病生存时间为24.9个月；miR-622高表达组患者的中位总生存时间为71.6个月，中位无病生存时间为59.8个月。miR-622低表达组患者5年无病生存率和总生存率分别为22.1%、28.5%，miR-622高表达组患者5年无病生存率和总生存率分别为55.6%、58.1%，两组比较差异有统计学意义 （Log-rank χ2=26.247、20.175，P=0.000、0.000）。见图 1。

3 讨 论

图1 不同miR-622表达水平的结肠癌患者无病生存率和总生存率分析

目前，外科手术切除是结肠癌的主要治疗措施，虽然结肠癌手术及药物治疗取得了一定的发展，但进展期和转移性患者的总生存率仍无明显提高，预后仍旧不理想［10］。近年来，miRNA的异常表达在恶性肿瘤发生、发展及预后中的作用研究已成为关注热点之一，其有望为肿瘤的治疗和预测预后提供新的方向［11］。迄今为止，在结肠癌组织或细胞系中已发现多种异常表达的miRNA［12］，miR-622即为其中之一。

miR-622位于13号染色体q31.3，目前已有研究显示miR-622在人类多种恶性肿瘤表达下降，扮演着抑癌基因的角色。Song等［7］的研究发现miR-622在食管鳞癌中表达明显下降，并能够抑制癌细胞的肿瘤生物学行为。 Wang 等［8］和 Wang 等［9］分别在胶质瘤细胞和甲状腺乳头状癌组织中也发现miR-622表达水平下降，起着类似抑癌基因的作用。但目前有关miR-622在结肠癌中的表达情况的研究较少。Fang等［13］学者在研究中发现miR-622在结肠癌细胞中的表达水平较正常结肠上皮细胞明显降低。本文研究通过qRT-PCR检测了110例结肠癌组织和相对应的癌旁正常组织中miR-622的表达水平，取得与Fang等［13］研究一致的结论。此外，本文研究通过进一步统计分析发现miR-622低表达者血管淋巴管浸润、淋巴结转移、III～IV期及远处转移的占比高于高表达患者，提示miR-622表达异常与结肠癌的发生发展及转移有关。

体外细胞学实验已经证实miR-622在食管癌［7］、恶性胶质瘤［8］、肺癌［14］、肝癌［15］等多种肿瘤细胞中表达水平降低，通过转染miR-622类似物提高miR-622的表达能够影响肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭或迁移能力。Fang等［13］在研究也发现转染miR-622类似物提高miR-622的表达能够明显抑制结肠癌细胞的增殖和侵袭迁移能力，miR-622在结肠癌中起着类似抑癌基因的作用。但目前有关miR-622与恶性肿瘤患者预后关系的研究目前较少，并且结果不一致。有研究发现，BRCA1基因缺失的卵巢浆液性癌患者在铂类药物化疗后miR-622的高表达与患者的不良预后相关，可能与miR-622介导的化疗药物耐药有关［16］。本研究中我们对患者进行了术后随访，分析miR-622表达水平与结肠癌患者预后的关系，结果发现miR-622低表达的结肠癌患者5年总生存率和无病生存率均低于miR-622高表达者，提示miR-622低表达的结肠癌患者预后较差。

综上所述，结肠癌组织中miR-622的表达较癌旁正常组织降低，其与患者血管淋巴管浸润、淋巴结转移、远处转移及较晚的临床分期及不良预后有相关，miR-622或有望成为结肠癌预后评估的分子标志物。