shRNA介导黑素瘤A375细胞Cbl⁃b基因沉默前后蛋白质组学分析

王小坡 倪娜娜 熊竞舒 宋昊 姜祎群 陈浩 曾学思 孙建方

210042南京，中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病医院病理科

Casitas B⁃lineage lymphoma（Cbl）⁃b 是 Cbl家族成员之一，属于环指型泛素连接酶，在肿瘤发病中可通过其N-端酪氨酸激酶结合（TKB）结构域识别并结合底物蛋白酪氨酸激酶，从而启动底物泛素化降解，参与细胞内信号转导的负向调控。Fan等［1］发现，Cbl⁃b可通过泛素化降解黏着斑激酶（FAK）使胃癌细胞解离，从而促进胃癌转移。Kang等［2］发现，Cbl/Cbl⁃b可作为连接蛋白与Smad3结合，抑制转化生长因子（TGF）⁃β信号通路，从而参与乳腺癌发病过程。我们前期研究发现，黑素瘤组织及细胞中Cbl-b基因mRNA及蛋白表达均明显高于色素痣组织及正常黑素细胞，并且可促进黑素瘤细胞株A375增殖、侵袭及转移，但相关的分子基础及信号通路仍不明确［3］。本研究中我们采用非标记定量蛋白质组学技术，比较Cbl⁃b shRNA慢病毒载体沉默A375细胞株及阴性对照A375细胞株蛋白表达差异，并对差异蛋白进行基因本体（gene ontology）富集及京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia ofgenes and genomes，KEGG）通路富集分析，探讨Cbl⁃b参与黑素瘤发病的相关蛋白及可能机制。

材料与方法

一、材料

C18 Cartridge、C18上样柱（EASY column SC001 traps150μM×20mm，RP⁃C18）、C18分析柱（EASY column SC200 150μM× 100mm，RP⁃C18）均来自美国Thermo公司，BCA定量试剂盒来自上海碧云天生物技术有限公司，鼠抗人Cbl⁃b单克隆抗体为美国Santa Cruz公司产品，鼠抗人促红细胞生成素产生肝细胞受体A2（EphA2）、糖原合成酶激酶3（GSK3）β、蛋白激酶B（AKT）、磷酸化蛋白激酶B（p⁃AKT）多克隆抗体均为美国Bioworld公司产品。Q⁃Exactive质谱仪、Easy⁃nLC 1000纳升级液相色谱（美国Thermo Fisher公司）。

A375细胞系（美国模式培养物保藏中心）由本所中心实验室保存，在以往研究中构建慢病毒shRNA Cbl⁃b A375细胞系（用shRNA Cbl⁃b慢病毒载体转染72 h）及对照A375细胞系（用对照慢病毒载体转染72 h）［4］。

二、试验方法

1.转染后A375细胞蛋白提取及电泳：转染后72 h提取慢病毒shRNACbl⁃b沉默组及对照组A375细胞蛋白，蛋白样品加入200μl SDT裂解液（4%SDS，100 mmol/L 二硫苏糖醇，100 mmol/L Tris，pH8.5），超声处理（100W，工作10 s，间歇10 s，循环10次）；沸水浴10min；14 000×g离心30min，取上清液；BCA法进行蛋白定量。每组各取20μg样品加入5×上样缓冲液，沸水浴5min，14 000×g离心10 min取上清液，SDS⁃PAGE电泳，考马斯亮蓝染色。

2.蛋白样品酶解（filter⁃aided samplepreparation，FASP）：每组取192μg蛋白裂解样品，加入二硫苏糖醇至终浓度为100 mmol/L，沸水浴5min；加入200μl尿素缓冲液稀释混匀，14 000×g离心15min（重复1次），弃滤液；加入100μl含50mmol/L碘乙酰胺的尿素缓冲液，振荡1min，避光室温孵育30min后14 000×g离心10min；加入100μl尿素缓冲液，14 000×g离心10min（重复2次）；加入100μl碳酸氢铵缓冲液，14 000×g离心10min（重复2次）；加入40μl含4μg胰酶碳酸氢铵的缓冲液，振荡1min；37℃酶解16～18 h；换新收集管，14 000×g离心10 min，收集滤液；滤液经 C18⁃SD Extraction Disk Cartridge脱盐处理，之后根据吸光度A280对肽段定量。

3.酶解产物的LC⁃MS/MS分析（上海中科新生命生物科技有限公司协助完成）：采用HPLC液相色谱系统EASY⁃nLC1000分离，流速为400 nl/min。采用Q⁃Exactive质谱仪进行质谱分析。分析时长120min，检测方式为正离子，母离子扫描范围300～1 800质量电荷比（m/z）。多肽和多肽碎片m/z按照下列方法采集：每次全扫描后采集20个碎片图谱，激活方式为高能量碰撞解离（HCD），隔离窗口为2m/z。一级质谱分辨率200m/z时为70 000，二级质谱分辨率为17 500。

4.数据库检索与定量分析：应用MaxQuant软件（版本号1.3.0.5）对质谱原始文件进行定量分析。主要参数如下：最大容许漏切位点为2，酶为胰蛋白酶，半胱氨酸脲甲基化修饰为固定修饰，甲硫氨酸氧化和蛋白N末端乙酰化为可变修饰，MaxQuant所得查库文件使用Perseus软件进行分析（版本号1.3.0.4）。差异蛋白筛选标准为Cbl⁃b shRNA沉默组/对照组非标定量强度＞2或＜0.5，同时满足P＜0.05。

5.生物信息学分析：用Cluster 3.0软件分析差异蛋白，Java Tree View软件生成层次聚类热图。用Blast2GOCommand Line软件分析基因本体条目生物学过程、分子功能及细胞组分富集情况；用KAAS（KEGG Automatic Annotation Server）软 件 分 析KEGG通路富集情况。

6.Western 印迹检测 Cbl⁃b、EphA2、GSK3β、AKT、p⁃AKT蛋白表达：方法同文献［4］。转染后72 h提取shRNA沉默组和对照组总蛋白，蛋白变性、上样，SDS⁃PAGE电泳、转膜、封闭，分别加入鼠抗人Cbl⁃b单克隆抗体（1∶500）和EphA2（1∶500）、GSK3β（1∶500）、AKT（1∶800）、p⁃AKT（1∶800）多克隆抗体及鼠抗人GAPDH抗体（1∶1 000）孵育过夜等。用Image J软件分析条带灰度，以对照组条带灰度值为1，计算目的蛋白相对表达量。

7.统计学方法：采用SPSS 23.0软件进行统计分析，数据以x±s表示。Cbl⁃b shRNA沉默组和对照组间蛋白丰度比较采用两样本t检验（n=3）。基因本体及KEGG富集分析采用Fisher精确概率法检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、细胞蛋白提取及Cbl⁃b蛋白沉默效果

BCA法检测阴性对照组蛋白浓度为（3.126±0.108）g/L，Cbl⁃b shRNA 组蛋白浓度为（6.024 ±0.227）g/L。由考马斯亮蓝图谱看，各样品条带分离清晰，蛋白提取效果良好（图1）。Western印迹表明，Cbl⁃b shRNA组Cbl⁃b蛋白相对表达量显著降低（图2）。

图1 A375细胞提取蛋白十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳图 M：蛋白分子标记物；1～3：阴性对照组；4～6：Cbl⁃b shRNA沉默组

图2 Western印迹检测Cbl⁃b在两组A375细胞中的表达

二、蛋白质鉴定及差异蛋白分析

本次共鉴定肽段23 579个，蛋白质3 449个。所定量到蛋白质序列信息批量提取自UniProtKB数据库（版本号：201701）。两组间差异表达的蛋白质为74个，其中Cbl⁃b shRNA沉默组较对照组表达上调的蛋白52个，下调的蛋白22个。上调或下调倍数排名前10位的蛋白分别见表1、2。

三、蛋白聚类分析

利用筛选的差异蛋白对Cbl⁃b shRNA重组慢病毒沉默组和对照组进行层次聚类，结果显示差异蛋白可以有效区分样本，即挑选的差异蛋白合理、准确（图3）。

四、差异蛋白基因本体富集分析

前5位显著富集生物学过程为整合素介导细胞黏附、单一生物代谢过程、整合素介导细胞黏附调节、蛋白质靶向线粒体调节、核酸代谢过程；前5位显著富集分子功能为DNA结合、2，2铁硫簇合物结合、信号受体活性、钙黏蛋白结合、细胞黏附分子结合；前5位显著富集的细胞组分为核小体、DNA包装复合体、光感器连接纤维、DNA-蛋白质复合体、胞外区部分。

表1 慢病毒Cbl⁃b shRNA沉默组A375细胞中表达上调的蛋白（n=3，与阴性对照组相比差异倍数排名前10位）

表2 慢病毒Cbl⁃b shRNA沉默组A375细胞中表达下调的蛋白（n=3，与阴性对照组相比差异倍数排名前10位）

图3 差异蛋白对Cbl⁃b shRNA重组慢病毒沉默组和阴性对照组层次聚类热图 红色表示上调，绿色表示下调

五、差异蛋白KEGG富集分析

前5位与黑素瘤相关的显著富集通路包括叶酸生物合成、轴突导向、细胞外基质受体相互作用、黏合连接、Wnt信号通路（图4）。

六、Western印迹验证部分差异蛋白质的表达水平

Cbl⁃b shRNA沉默组A375细胞EphA2表达下调（0.369），GSK3β表达上调（3.524）（图5A）。Western印迹检测结果与LC⁃MS/MS研究结果一致。

七、沉默Cbl⁃b表达对AKT、p⁃AKT表达的影响

Western印迹检测表明Cbl⁃b shRNA沉默组A375细胞AKT表达水平与对照组类似（1.04），p⁃AKT表达水平（0.453）降低，见图5B。

图4 差异蛋白显著富集的KEGG条目统计图 点的大小表示通路中差异表达基因条数多少，点的颜色对应不同的negLog10_Pvalue范围

图5 Western 印迹检测A375细胞中EphA2、GSK3β（5A）及AKT、p⁃AKT（5B）蛋白表达 EphA2：促红细胞生成素产生肝细胞受体A2；GSK3β：糖原合成酶激酶3β；AKT：蛋白激酶B；p⁃AKT：磷酸化蛋白激酶B

讨 论

蛋白质组学通过凝胶电泳、质谱等技术产生的海量数据反映生物体内发生的全部过程及变化。从这些庞大而复杂的实验数据中寻找生物体的改变以及引起这些改变的源头和机制，是蛋白质组生物信息学的主要任务。使用siRNA沉默目的基因进行差异蛋白质组学表达分析，可以了解与特定基因功能丧失相关的蛋白质表达的整体变化［5⁃6］。本研究采用非标记定量蛋白质组学成功鉴定74个在Cbl⁃b shRNA慢病毒载体转染A375细胞株与空白慢病毒载体转染A375细胞株间差异表达的蛋白质，其中52个蛋白质在Cbl⁃b shRNA沉默组表达上调，22个蛋白质表达下调。

基因本体是生物学的统一化工具，包括3大独立的本体：分子功能、生物过程和细胞组分。我们对差异蛋白集合基因本体条目富集分析发现，显著富集分子功能包括DNA结合、2，2铁硫簇合物结合、信号受体活性、钙黏蛋白结合等，这与显著富集的生物学过程细胞黏附及细胞代谢过程相一致，这些过程与功能均在肿瘤的增殖、侵袭中起重要作用。我们对差异蛋白-KEGG条目富集分析发现，黑素瘤相关的显著富集通路主要包括叶酸生物合成、轴突导向、细胞外基质受体相互作用、黏合连接、Wnt信号通路、Hippo信号通路、叶酸拮抗、氧化磷酸化、PI3K⁃Akt信号通路等。叶酸生物合成通路及叶酸拮抗剂抵抗通路值得关注，因为膳食叶酸摄入对雌激素受体阴性的乳腺癌有保护作用［7］；此外，许多研究表明，叶酸在生物甲基化和核苷酸合成中具有核心作用，可以调节癌变［8］。多种通路与细胞过程和环境信息处理有关，如黏合连接、细胞外基质受体相互作用信号通路与黑素瘤密切相关［9］。另外，信号转导通路如Wnt、Hippo、PI3K⁃AKT信号通路与黑素瘤的发生发展密切相关［10⁃13］。因此，敲除黑素瘤 A375 细胞株Cbl⁃b可能通过多种信号通路影响黑素瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭及转移。

由于GSK3β可通过Wnt/β联蛋白和Hedgehog信号通路负性调节癌基因和细胞周期调节因子，因此GSK3β是抑制肿瘤发生和肿瘤进展的抑癌基因。Eph家族是受体酪氨酸激酶家族成员中最大亚族，EphA2是EphA亚家族中的一员。在乳腺癌、卵巢癌和黑素瘤等肿瘤中EphA2均高表达，并且可通过非配体依赖途径促进肿瘤进展［14⁃15］。我们选择这两个蛋白通过Western印迹验证蛋白质组学可靠性，结果表明，Western印迹实验结果与蛋白质组学结果一致。

我们发现，在黑素瘤A375细胞株中，Cbl⁃b沉默后，EphA2表达下降，因此Cbl⁃b与EphA2可能共同促进黑素瘤进展。EphA2可通过多种信号通路参与肿瘤发病，如 JAK/STAT、Ras/MAPK、PI3K/AKT和integrins/FAK/paxillin/Rho等［16］。沉默 Cbl⁃b表达可阻断AKT的磷酸化过程，从而抑制PI3K⁃AKT信号通路的过度活化。

综上所述，我们利用比较蛋白质组学分析Cbl⁃b沉默A375细胞后差异蛋白表达，共鉴定72个Cbl⁃b相关蛋白。生物信息学分析发现，差异蛋白涉及多种生物学功能及信号通路。因此推测Cbl⁃b可能通过多种信号通路参与黑素瘤发病过程，其中Cbl⁃b激活EphA2/PI3K/AKT信号通路可能是黑素瘤发生发展的重要分子机制之一，其他信号通路仍值得深入研究。