空气污染对皮肤角质层蛋白羰基化水平的影响及粉红胡椒木提取物和脂质混合物对皮肤损伤的防护作用

江月明 赵小敏 瞿欣

200233上海，亚什兰（中国）投资有限公司

角质层是机体抵御外界环境刺激的第一道屏障。环境污染物如颗粒物、紫外线和臭氧等侵害皮肤的重要机制是通过氧化损伤攻击皮肤表层的不饱和脂质，破坏皮肤最外层的保护层，产生活性羰基类物质，如丙二醛、4-羟基壬烯醛、丙烯醛等。这类物质超过机体的清除能力即出现羰基应激，将诱导蛋白质等生物大分子的羰基化修饰，使其发生结构改变和功能丧失，从而加速皮肤衰老，或者引发皮肤的各种病态反应［1⁃3］。Iwai等［4⁃6］指出蛋白羰基化会损伤角质层的保水能力，影响皮肤透光率，改变皮肤的光学特性等。粉红胡椒木提取物富含多酚类物质槲皮苷和半乳糖苷，有很强的抗氧化特性［7⁃10］，体外实验证实其通过维持角质形成细胞活性，调控与表皮屏障相关的生物标记物来增强皮肤屏障功能预防空气污染。脂质混合物（prolipid 141）主要成分为来源于植物的油水两亲分子物质，可在皮肤表层形成稳定的仿生脂质的层状凝胶相结构，物理性增加皮肤屏障功能，预防污染损伤［11⁃12］。我们利用定制的污染模拟箱，以香烟烟雾模拟污染物，建立污染损伤模型，以角质层蛋白羰基化水平表征皮肤的氧化损伤程度，在体评价粉红胡椒木提取物和脂质混合物对皮肤损伤的预防作用。

材料与方法

1.试剂和仪器：定制的污染模拟箱（上海利捷科学仪器有限公司），Atlas SUNTESTCPS+日光模拟测试箱（德国Atlas公司），D500 D⁃Squame按压器（美国Cuderm公司），D100 D⁃suqame胶片（美国Cuderm公司），荧光素-5-氨基硫脲（fluorescein⁃5⁃thiosemicarbazide，FTZ，上海阿拉丁试剂公司），Image⁃Pro Analyzer 7.0图像分析软件（美国Mediacybernetics公司），粉红胡椒木提取物溶液（商品名为Elixiance，美国亚什兰集团公司），脂质混合物（商品名为Prolipid 141，美国亚什兰集团公司）。下文中提到的粉红胡椒木提取物均为粉红胡椒木提取物和丙二醇与水的混合溶液，脂质混合物为甘油硬脂酸酯、山俞醇、棕榈酸、硬脂酸、月桂醇、肉豆蔻醇和鲸蜡醇混合物。

2.受试者：入选标准为18～65岁健康志愿者，以室内工作为主。排除标准：体质高度敏感或对香烟烟雾敏感者；有光敏感病史者；面部和手臂有皮肤疾病者；存在任何影响皮肤表面形态的行为者，如行表皮剥脱术或使用含维A酸、果酸等外用制剂；面部或前臂屈侧有瘢痕、色素斑等影响结果判断者。根据上述条件共入选受试者79名，年龄（44.7±11.0）岁，均为室内工作者，其中女性53名，年龄（44.1±10.5）岁；男性26名，年龄（45.9±12.2）岁。所有受试者均签署知情同意书。以下所有人体测试均基于赫尔辛基宣言，且已经通过美国亚什兰公司毒理学部门的毒理学安全性审核。

3.人体不同部位蛋白羰基化水平检测：健康受试者34名，年龄（40.1±11.1）岁，均为室内工作者。其中女性21名，年龄（40.5±11.4）岁；男性13名，年龄（39.5±11.1）岁。先通过预实验确定D⁃squame胶片取样量对蛋白羰基化水平的影响：选取其中4名受试者，在其额部、面颊部、前臂屈侧和腰背部分别用两种不同的压力采集D⁃squame胶片，每个部位均获得两片取样量差异较大的样本，共计32片角质层样本；精密天平称量胶片采集前后的重量，差值即角质层重量，再对各样品蛋白羰基化水平进行分析。分析显示，角质层重量与蛋白羰基化水平相关性很低（R2=0.039 5），见图1。因此，D⁃squame胶片取样量对于比较不同部位蛋白羰基化水平的影响微弱。之后，分别在受试者额部、面颊、前臂屈侧和腰背部采集皮肤角质层样品，荧光标记分析不同部位蛋白羰基化水平。

4.人体污染暴露：定制的污染箱可以把微细颗粒或者香烟等污染物泵入密封的箱体内，并通过空气循环对流使污染物在箱体里均匀分散。15名受试者，年龄（47.8±7.2）岁，均为室内工作者，其中女性12名，年龄（49.2±7.5）岁；男性3名，年龄（42.3±1.5）岁。志愿者单侧前臂用自来水内外冲洗各30 s，并于等候区［环境温度（20±2）℃，相对湿度40%～60%］适应30min后，单侧前臂屈侧（含手掌）向上伸入污染模拟箱中暴露于以香烟烟雾模拟的空气污染，确保暴露期间箱体内PM10和PM2.5浓度均大于1 000μg/m3（实验监测显示，吸烟时面部附近颗粒物浓度可达1 200 μg/m3）［13］。分别于暴露后0、1、2、4、5 h用D⁃squame胶片采集前臂屈侧角质层样本，即用镊子夹取D⁃squame胶片平整贴于前臂屈侧手腕到手肘之间的皮肤，用D⁃Squame按压器（225 g/cm2）按压10 s后，撕取并封存于静电贴膜中，置于-80℃冰箱保存。

5.粉红胡椒木提取物和脂质混合物对皮肤损伤的短期预防作用：先通过预实验确定角质层自体荧光和相邻区域蛋白羰基化水平的差异，即在前臂屈侧相邻区域取2片表层角质层样本，分别于荧光染色前后进行显微镜拍照分析，发现角质层自体荧光非常微弱，可以忽略不计。同时，相邻区域皮肤的羰基化水平很接近，可以作为平行样品对照。入选14名健康受试者，年龄（46.6±7.8）岁，均为室内工作者，其中女性11名，年龄（47.8±8.5）岁；男性3名，年龄（42.3±1.5）岁。在每名受试者单侧前臂屈侧选取3处5 cm×5 cm区域，分别外用2mg/cm21%粉红胡椒木提取物的水溶液（胡椒木组）、去离子水（对照组）或不涂任何样品（空白组），并于等候区［环境温度（20±2）℃，相对湿度40%～60%］适应15min后将手臂置于污染模拟箱中暴露5 h，期间严格监控受试者以避免任何影响测试结果的行为，从而保证试验的重复性。暴露前后采集各区域角质层样本，检测皮肤蛋白羰基化水平。另选16名健康受试者，年龄（42.2±10.6）岁，均为室内工作者，其中女性13名，年龄（42.2±11.8）岁；男性3名，年龄（42.3±1.5）岁。单侧前臂屈侧选取3处5 cm×5 cm区域后，分别外用2mg/cm2含5%脂质混合物的乳液（脂质混合物组）、不含脂质混合物的安慰剂乳液（对照组）或不涂任何样品（空白组）。暴露前和暴露5 h后采集各区域角质层样本，用于检测皮肤蛋白羰基化水平。

6.粉红胡椒木提取物的长期预防作用：选择上海市污染相对最严重的冬季（测试期间平均大气污染指数AQI为105，PM2.5为98），健康受试者20名，年龄（53.9±7.7）岁，均为室内工作者，其中女性10名，年龄（52.6±5.7）岁；男性10名，年龄（55.2±9.5）岁。采用双盲半脸测试，随机选择左右半脸分别外用含1%粉红胡椒木提取物的自配乳液（主要成分为水、棕榈酸异辛酯、乳木果油、甘油丙烯酸酯/丙烯酸共聚物、PEG⁃100硬脂酸酯、甘油硬脂酸酯、粉红胡椒木提取物、丙烯酸/乙烯基吡咯烷酮交联共聚物等）和不含粉红胡椒木提取物的安慰剂乳液，均为每日早晚2次。受试者来访第1天（未使用产品）和使用产品56 d后，采用D⁃Squame胶片在受试者的面颊部和额部分别采集角质层样本，测定蛋白羰基化水平。

7.蛋白羰基化水平检测［14］：将带角质层样本的D⁃squame胶片浸入40μmol/L荧光素-5-氨基硫脲溶液中，室温置于暗处1 h。荧光染色后，取出胶片用PBS溶液冲洗3次，带胶侧朝上置于载玻片上，用荧光显微镜观察并随机选取3个视野拍摄照片（放大倍数：25和100；FTZ激发波长492 nm，入射波长516 nm）。采用Image Pro Plus 7.0软件对25×图像进行分析，仅选取荧光显色区域，计算其平均荧光强度，以其代表蛋白羰基化水平。

图2 身体不同部位蛋白羰基化水平（×100）绿色区域为荧光标记的角质层羰基化蛋白，颜色越亮代表蛋白羰基化水平越高

图3 前臂屈侧暴露于香烟烟雾不同时间后皮肤蛋白羰基化水平（×100） 绿色区域为荧光标记的角质层羰基化蛋白，颜色越亮代表蛋白羰基化水平越高

8.统计学方法：采用JMP10软件进行统计分析，计量资料以±s表示。数据均符合正态分布，采用单因素方差分析多样本间差异，两样本间做LSD⁃t检验。长期人体测试中左右面颊的蛋白羰基化水平比较采用配对样本单尾t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.人体不同部位蛋白羰基化水平（平均荧光强度）：34名受试者面颊和额部高于手臂和腰背部，且荧光强弱的分布更不均匀，见图2。面颊、额部、手臂和腰背部蛋白羰基化水平分别为26.3±7.1、22.9±7.9、14.7±4.9和12.6±4.2（F=37.768，P ＜0.001），手臂部显著高于腰背部（t=2.031，P=0.046）。从科学性和可操作性综合考虑，在之后的测试中，选用受试者前臂屈侧暴露于污染模拟箱中。

2.污染暴露对皮肤蛋白羰基化水平的影响：15名受试者将前臂屈侧暴露于香烟模拟的污染箱中后，随暴露时间增加，蛋白羰基化水平持续增加，且与时间线性相关（R2=0.995 9），在暴露前和暴露1、2、4、5 h后分别为14.5± 3.67、20.2± 4.46、25.5±4.00、29.4±5.30和34.3±7.80，各时间点之间差异有统计学意义（F=17.278，P ＜0.001），见图3。

图4 粉红胡椒木提取液对皮肤蛋白羰基化的抑制作用（×100） 绿色区域为荧光标记的角质层羰基化蛋白，颜色越亮代表蛋白羰基化水平越高

3.粉红胡椒木提取物和脂质混合物对皮肤损伤的预防作用：短期的人体污染暴露实验显示，与空白组及对照组相比，胡椒木组香烟烟雾引起的皮肤损伤降低，见图4。其中，胡椒木组（14名）暴露后角质层蛋白羰基化水平升高值为9.7±5.2，低于空白组和对照组（19.0±10.0、18.5±7.3，F=6.302，P=0.004），差异均具有统计学意义（t值分别为3.156、2.986，P值分别为0.001 5、0.002 4）。16名受试者5%脂质混合物乳液处理的区域暴露后角质层蛋白羰基化水平升高值为5.8±4.9，低于空白组和对照组（17.4± 8.8、15.9± 6.4，F=13.580，P ＜0.001），差异均有统计学意义（t值分别为4.792、4.170，均P＜0.001）。受试者试验中未发生不良反应。

4.粉红胡椒木提取物的长期预防作用：20名受试者与使用前相比，使用56 d后，面颊部提取物侧和安慰剂侧角质层蛋白羰基化水平变化值分别为-3.6±8.5和1.5±7.8，与安慰剂侧相比，提取物侧面部蛋白羰基化水平显著降低，差异有统计学意义（t=2.156，P=0.022），14例受试者提取物侧蛋白羰基化水平低于安慰剂侧。受试者试验中未发生不良反应。

讨 论

随着空气污染日益成为公众关注的焦点，越来越多的研究揭示空气污染对皮肤的影响及其损伤机制［15⁃17］，但是鲜少提及具体的评价方法。欧莱雅（中国）有限公司的一项研究利用污染导致角质层不饱和脂质减少的机制，将高效液相色谱法测定的角鲨烯含量作为评价角质层脂质屏障受损的标记［18］。我们首次将角质层蛋白羰基化水平作为污染对皮肤损伤程度的标记物。尽管脂质屏障是最先遭到氧化损伤的对象，但是皮肤的修复机制可以抵御轻度的氧化损伤，持续过度的氧化损伤，才会进一步攻击蛋白和DNA等［19］，进而引起外源性老化。因此，蛋白的羰基化修饰是皮肤更深层次的氧化损伤。相较于脂质屏障受损标记物角鲨烯，它能更准确全面地反映皮肤的损伤程度。但本研究未设相应标准对照，因而尚须进一步研究证实。蛋白羰基化水平作为衡量蛋白质氧化损伤的通用指标，有较多的测定方法，包括传统的分光光度法、仪器分析法、Western印迹和酶联免疫方法等［20］。我们采用一种直观简便的蛋白羰基化检测方法，即通过胶带剥离法采集样本，并以荧光标记法结合Image⁃Pro Analyzer 7.0软件分析D⁃squame胶片的荧光强度来表征角质层蛋白羰基化水平。传统的分光光度法采用2,4-二硝基苯肼对角质层羰基化蛋白进行衍生化，需要毫克级蛋白且需经多次沉淀、洗涤和复溶，不仅操作步骤繁琐，而且容易造成蛋白损失［20］。本方法基于同等原理，通过荧光素-5-氨基硫脲的肼基与角质层蛋白的羰基结合进行标记，相比之下更简便且能以图像的形式直观反映角质层的损伤程度［14］。

我们引入定制污染模拟箱，以香烟烟雾模拟空气污染，在体评价污染对皮肤的损伤。由于污染模拟箱在皮肤损伤研究方面的应用较少，因而这类仪器尚待进一步标准化。香烟烟雾的组成类似于空气污染中的化石燃料燃烧产物，且已被证实是室内PM污染的主要因素［21⁃22］。同时，香烟烟雾在呼吸道和心血管疾病方面表现出与空气污染类似的健康风险［23］，以其作为模拟污染物具有一定的代表性。对污染模型的影响因素进行评估，证实角质层自体荧光对实验无影响，且相邻区域皮肤羰基化水平较为接近，因而在短期暴露测试中，将相邻区域作为平行样品的对照区域。人体不同部位由于在污染空气和紫外线中暴露程度不同，羰基化水平也存在显著性差异，面颊和额部为严重曝光部位，其蛋白羰基化水平最高，手臂为次级曝光部位，腰背部为非曝光部位，蛋白羰基化水平最低。人体长期曝光部位的蛋白羰基化水平更高是综合因素作用的结果，空气污染物协同紫外线可加剧皮肤的氧化损伤［24］。基于以上研究，利用该污染模型通过短期模拟加速暴露实验评估粉红胡椒木提取物和脂质混合物对皮肤损伤的预防作用，结果显示，粉红胡椒木提取物和脂质混合物组皮肤暴露后角质层蛋白羰基化水平升高值显著低于空白组和对照组。同时，我们选择污染严重的冬季，通过长期测试发现，受试者使用含1%粉红胡椒木提取物的乳液8周后，面部蛋白羰基化水平显著低于安慰剂侧，进一步证实粉红胡椒木提取物对皮肤损伤有持续预防作用。粉红胡椒木提取物中富含的槲皮苷和半乳糖苷赋予其很强的抗氧化特性，可在短期污染暴露中即时减轻空气污染物的氧化损伤，且在长期使用后，粉红胡椒木提取物还可能通过调控与表皮屏障相关的生物标记物，如调节与皮肤代谢相关的非编码RNA促进表皮分化［25⁃26］，同时促进紧密连接蛋白、钙黏蛋白、内披蛋白、半胱天冬酶等标记物的表达来增强皮肤自身的屏障功能抵御空气污染［27］。脂质混合物在生理温度下可以模拟角质层脂质的有序层状结构，同时其随温度变化的特性也和角质层脂质很接近［28］，因此外用含脂质混合物的乳霜后，可在皮肤表层铺展形成稳定的仿生脂质结构，从而物理性增强皮肤屏障，即时预防空气污染损伤。

利益冲突声明本试验与亚什兰（中国）投资有限公司存在利益关系。本研究中心隶属于亚什兰（中国）投资有限公司，实验所有资源和资金均由亚什兰（中国）投资有限公司提供