白细胞介素22对人表皮角质形成细胞CC趋化因子配体27表达的影响

周文娇 任杰 韩珑 刘欣欣 汤坤龙 罗素菊

300052天津医科大学总医院皮肤科（周文娇、任杰、韩珑、罗素菊），泌尿外科（汤坤龙）；天津市儿童医院皮肤科（刘欣欣）

CC趋化因子配体27（CCL27）是皮肤发育和角质形成细胞分化过程中发挥调节作用的重要因子之一［1］，研究表明，CCL27及其受体CCR10在银屑病皮损的角质形成细胞及血清中异常表达［2⁃6］。我们的前期［7⁃8］研究表明，白细胞介素22（IL⁃22）作为Th22细胞的效应因子，可促进HaCaT细胞增殖，抑制HaCaT细胞凋亡和分化，并且可通过MAPK⁃ERK1/2和JAK2/STAT3这两条信号通路诱导肝素结合表皮生长因子样生长因子（heparin⁃bingding epidermal⁃growth⁃factor⁃like growth factor）表达和抑制他扎罗汀诱导基因3（tazarotene⁃induced gene 3）表达。推测IL⁃22也可以通过这两条信号通路对在角质形成细胞分化过程中起重要作用的CCL27存在调控作用。本研究进一步探讨银屑病中IL⁃22对趋化因子CCL27表达的调控。

一、材料与方法

1.细胞株及主要材料：HaCaT细胞系由德国柏林自由大学本杰明·富兰克林医学中心惠赠，在实验室长期保存。重组人IL⁃22（美国 Protein Specialists公司），抗人 CCL27/CTACK抗体（美国RD公司），抗β肌动蛋白单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司），PD98059（MAPK⁃ERK1/2通路抑制剂）、AG490（JAK2/STAT3通路抑制剂）（美国Millipore公司），DMEM培养基（美国Gibico公司），人CCL27酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒（美国RD公司），超敏二步法免疫组化检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

2.免疫组化检测银屑病患者皮损中CCL27的表达：10例银屑病组织标本来自天津医科大学总医院皮肤科病理组织蜡块，男5例，女5例，年龄18～50岁（平均22.3岁），其中2例来自颈后部，8例来自躯干；5例健康人皮肤标本来自天津医科大学总医院整形美容科，男3例，女2例，年龄20～36岁（平均23.5岁），其中1例来自面部，1例来自颈部，3例来自躯干。本研究获得天津医科大学总医院医学伦理委员会批准，受检者均签署知情同意书。采用超敏二步法免疫组化检测，按产品说明书操作，二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木精复染，脱水、封片，显微镜下观察。

3.细胞培养及分组：HaCaT细胞复苏后，置于37℃、5%CO2孵箱中用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养液培养。取对数生长期细胞进行消化，按1×105/Ml接种于6孔板中，待细胞70%～80%融合时，更换成含有0.5%胎牛血清的DMEM培养液饥饿处理2 h，之后更换新的培养液，分为8组，对照组用PBS处理；干预组分别用12.5、25、50、100、200μg/L重组人IL⁃22干预；通路阻断组先分别加入50μmol/L AG490或50μmol/LPD98059阻断干预，2 h后各加入50μg/L（依据课题组前期研究［7⁃8］确定）IL⁃22。上述处理完成后，继续于37℃、5%CO2孵箱中培养24 h。

4.Western印迹检测CCL27蛋白表达：将上述各组HaCaT细胞用冷PBS洗3遍，每孔加100μl细胞裂解液和1μl蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF），于冰上裂解30min，收集细胞裂解液，4℃下离心（13 200×g）10min，取上清液。BCA法测蛋白浓度后进行Western印迹。用15%聚丙烯酰胺凝胶电泳，每孔上样量为30μg，电泳90min，稳流300mA，转膜40min，加入抗人CCL27/CTACK抗体4℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG室温孵育2 h，ECL显色。蛋白条带灰度值采用Image⁃pro plus3.0软件分析，以CCL27与内参β肌动蛋白的灰度值比值表示CCL27相对表达水平。实验重复3次。

5.ELISA法检测细胞培养上清液中CCL27含量：取上述各组HaCaT细胞上清液，按试剂盒说明书操作，用酶标仪在450 nm和570 nm处读取吸光度A值，建立标准曲线，获得样品中趋化因子CCL27的含量。实验重复3次。

6.统计学分析：计量资料用x±s表示。采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析和Dunnett⁃t检验，P＜0.05认为差异有统计学意义。

二、结果

1.CCL27表达：银屑病患者皮损中，CCL27在表皮全层角质形成细胞胞质中均有表达。而对照组中，CCL27主要表达于表皮基底层角质形成细胞胞质中，基底层以上表达较弱。见图1。

图1 CC趋化因子配体27（CCL27）在健康人皮肤及银屑病皮损中的表达（DAB染色）

2.IL⁃22干预及阻断MAPK⁃ERK1/2和JAK2/STAT3信号通路后HaCaT细胞中CCL27蛋白表达：Western印迹检测显示，12.5～200μg/L IL⁃22干预组和对照组HaCaT细胞CCL27表达量差异有统计学意义（F=314.722，P＜0.01），且IL⁃22干预组均显著高于对照组（P＜0.01）。IL⁃22+AG490组、IL⁃22+PD98059组与50 μg/L IL⁃22组间CCL27表达量差异有统计学意义（F=358.706，P＜0.01），且前两组均显著低于50μg/L IL⁃22组（均P＜0.01）。见图2、表1。

图2 白细胞介素22（IL⁃22）对HaCaT细胞CC趋化因子配体27（CCL27）表达的影响 1：对照组；2 ～ 6：分别为12.5、25、50、100、200 μg/L IL⁃22组；7：50 μg/L IL⁃22+AG490组；8：50 μg/L IL⁃22+PD98059组

表1 Western印迹法与ELISA法检测不同浓度白细胞介素22（IL⁃22）对HaCaT细胞CC趋化因子配体27表达的影响（±s）

表1 Western印迹法与ELISA法检测不同浓度白细胞介素22（IL⁃22）对HaCaT细胞CC趋化因子配体27表达的影响（±s）

注：n=3。a与对照组比较，P＜0.01；b与50 μg/L IL⁃22组比较，P＜0.01

组别对照组12.5 μg/L IL⁃22 25 μg/L IL⁃22 50 μg/L IL⁃22 100 μg/L IL⁃22 200 μg/L IL⁃22 50 μg/L IL⁃22+AG490 50 μg/L IL⁃22+PD98059 Western印迹法0.413±0.013 0.491±0.013a 0.620±0.019a 0.623±0.014a 0.802±0.052a 1.138±0.013a 0.411±0.019b 0.280±0.012b ELISA法（ng/L）26.370±0.490 33.403±0.748a 34.710±0.980a 37.486±0.748a 38.473±0.753a 39.783±1.020a 27.586±0.288b 35.846±0.757b

ELISA检测显示，12.5～200μg/L IL⁃22干预组与对照组CCL27分泌量差异有统计学意义（F=108.307，P＜0.01），且IL⁃22干预组均显著高于对照组（P＜0.01）。IL⁃22+AG490组和IL⁃22+PD98059组与50μg/L IL⁃22组间差异亦有统计学意义（F=208.192，P＜0.01），且前两组均显著低于50μg/L IL⁃22组（P＜0.01）。见表1。

三、讨论

本研究结果示，12.5～200μg/L IL⁃22干预处理后HaCaT细胞中CCL27表达水平升高，同时IL⁃22也可以促进HaCaT细胞分泌CCL27；加入信号通路阻断剂后CCL27表达均较未加抑制剂组减少。表明IL⁃22对CCL27的合成与分泌有促进作用；MAPK⁃ERK1/2和JAK2/STAT3信号通路在其中发挥了重要作用。

目前研究认为，CCL27是皮肤发育和角质形成细胞分化调节的重要因子之一［1］，主要由皮肤表皮角质形成细胞产生，大部分表达于胞质中，在银屑病患者皮损中CCL27mRNA和蛋白含量比银屑病非皮损区显著升高，并且在银屑病患者血清中CCL27水平升高［5⁃6］，CCL27与CCR10结合，趋化淋巴细胞进入皮肤，在T细胞介导的免疫反应中发挥重要作用。

对皮肤T细胞淋巴瘤的研究表明，血清IL⁃22水平与血清乳酸脱氢酶、可溶性IL⁃2受体及CCL27有关［9］。有研究表明，T细胞来源的TNF⁃α以及IL⁃1β可诱导CCL27表达，而IL⁃17可抑制人正常皮肤角质形成细胞中CCL27表达［10］。这些炎症因子都是银屑病发病的重要因子，IL⁃22是银屑病发病的另一重要炎症因子，因此我们推测，IL⁃22在银屑病患者体内可以干扰表皮CCL27的表达，进而影响角质形成细胞增殖和分化及表皮炎症浸润。结合前期研究［7⁃8］和本研究结果，我们推测IL⁃22可能通过MAPK⁃ERK1/2和JAK2/STAT3这两条信号通路影响CCL27表达。在银屑病患者皮损中，CCL27与其受体CCR10结合，在银屑病的角质形成细胞和淋巴细胞的相互作用中继续发挥作用，从而刺激表皮角质形成细胞的异常增殖、分化及炎症浸润［11］，其具体机制有待进一步研究。