T-SPOT.TB试验在活动性结核病诊断中的应用价值

景淑贤 陈宝荣 赵培明 常晓鹏 贾晓鹏 徐云智 韩玉霞 李莉

结核病（TB）是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染病。研究资料[1]显示全球有大约1/3的人曾感染过结核分枝杆菌，且近年发病率持续增高。因此，TB的预防和控制显得尤为重要。我国是结核病高发区，如何早期发现潜在的结核病患者是结核病防治的重点工作之一。目前临床实验室常用的诊断结核的方法有结核菌培养、抗酸染色、结核菌素皮试试验(TST)、荧光定量PCR、抗结核抗体检测(TB-Ab)和T细胞酶联免疫斑点试验（T-SPOT.TB）等，但各指标对结核病诊断的灵敏度和特异度不同。为评价T细胞酶联免疫斑点试验（T-SPOT.TB）在结核病快速辅助诊断中的应用价值，对2016年1～6月我院结核门诊就诊的200例疑似活动性结核病患者的T-SPOT.TB、TB-Ab、抗酸染色三项检查的结果进行回顾分析，并与临床最终诊断进行比较，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象2016年1～6月我院结核门诊就诊的200例疑似活动性结核病患者。年龄15～85岁，平均(50.0±20.0)岁；男125例，女75例。入选标准：年龄15～85岁的疑似活动性结核病患者，排除孕妇和哺乳期妇女；3项检查均送检。排除标准：诊断不明确病例和失访病例。

1.2 研究方法

1.2.1 患者样本采集、送检与测量 ①T-SPOT.TB试验：抽取入选患者空腹外周静脉血5ml，肝素抗凝；抗结核抗体试验：黄帽采血管分离的血清；抗酸染色：留取入选患者清晨起床漱口后咳出的深部的痰。②送检要求：2h内送检。③测量：就诊时记录体检情况并同时进行T 细胞酶联免疫斑点试验（T-SPOT.TB）(上海复星长征医学科学有限公司的T-SPOT.TB试剂盒)、抗结核抗体（TB-Ab）试验[法国VEDA LAB公司的TB-CHECK-1结核杆菌抗体检测试剂盒（免疫层析法）]、抗酸染色三种检查。

1.2.2 确诊病例入选 根据《肺结核诊断标准（WS 288-2008）》和《北京市结核病防治工作规范（2013年版）》，综合考虑临床症状、病原学、组织病理学、影像学等实验室检查或诊断性抗结核治疗有效等做出最终临床诊断。

1.2.3 对入选患者的临床确诊结果与来我院就诊时的上述三项指标检验结果进行回顾分析，比较上述3个项目对活动性结核诊断的灵敏度和特异度。

1.3 统计学方法采用SPSS 19.0软件进行数据处理。同时将入选患者的临床结果及每种检测方法的检测结果建立四格表。灵敏度指真正患病被准确的诊断为患病的百分比，反映一项试验检出患者的能力。特异度指真正无病被准确的诊断为未患病的百分比，反映一项试验检出非患者的能力。用卡方检验将各组灵敏度和特异度分别进行比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

200例疑似结核病患者最终临床诊断为结核病者110例，非结核病90例。3种方法检测结果与临床诊断结果见表1。T-SPOT.TB、TB-Ab、抗酸染色的灵敏度分别为94.55%、40.00%、10.91%，两两比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。T-SPOT.TB、TB-Ab、抗酸染色的特异度分别为77.78%、84.44%、100.00%。T-SPOT.TB与TB-Ab的特异度比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；T-SPOT.TB 与抗酸染色的特异度比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；TB-Ab与抗酸染色的特异度比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。

表1 3种方法检测结果与临床诊断结果比较（n）

3 讨论

本研究中T-SPOT.TB诊断活动性结核病的灵敏度为94.55%，明显高于其他两种检测方法的灵敏度，多篇文献[2～7]报道的T-SPOT.TB诊断活动性结核病灵敏度为84.5%～97.9%，本研究与文献报道基本一致。本研究中T-SPOT.TB的特异度为77.78%，与TB-Ab特异度比较无明显差异，二者都低于抗酸染色的特异度。下面基于T-SPOT.TB原理对活动性结核病患者T-SPOT.TB呈假阴性和非活动性结核病患者T-SPOT.TB呈假阳性原因进行分析讨论。

T-SPOT.TB试验由Lalvani等[8]在2001年创建，于2008年美国FDA批准用于结核感染的诊断。其检测原理是机体被结核分枝杆菌感染后体内淋巴细胞被致敏，当这些已致敏T淋巴细胞再次受到结核分枝杆菌特异性抗原ESAT-6和CFP-10刺激后，就会释放干扰素-γ（IFN-γ），再通过事先进行设计的抗体捕获细胞所分泌的特殊细胞因子通过酶联斑点显色表现出来。实验室技术人员通过计数酶联免疫斑点就可以于单细胞水平针对细胞因子的分泌状况进行检测。

本研究中5.45%(6/110)的活动性结核病患者T-SPOT.TB呈假阴性，目前的研究表明，出现假阴性的原因可能与淋巴细胞的数量与功能有关，也存在部分独立风险因素。本研究中考虑到T-SPOT.TB检测中每个孔的淋巴细胞计数会调整到统一的水平（2.5×105/孔），可以排除淋巴细胞数量减少对T-SPOT.TB灵敏度的影响。淋巴细胞的功能：研究表明[9～12]，结核分枝杆菌逃避了机体的免疫反应，造成免疫功能异常。逃避方式一：结核分枝杆菌进入巨噬细胞后通过释放大分子物质阻止内含体与溶酶体融合，进而阻止激活特异性免疫反应；逃避方式二：结核分枝杆菌可以干扰MHCⅡ类分子的合成与转运，进而影响T淋巴细胞识别活化；逃避方式三：结核分枝杆菌本身的毒力也可导致细胞死亡。独立风险因素：年龄增加、超重以及住院前有较长病程（＞6个月），Pan 等[13]的研究表明这部分患者淋巴细胞对结核特异抗原的免疫应答弱化或异常应答，导致T-SPOT.TB检测假阴性。

本研究中22.22%(20/90)的非活动性结核病患者T-SPOT.TB呈假阳性，有12例患者肺部CT提示为陈旧性结核，可能与记忆性 T 淋巴细胞长期存在有关。Kim 等[14]研究发现，既往结核病病史和影像学资料提示的钙化纤维增殖灶干扰T-SPOT.TB试验结果。另外8例患者既往无结核病接触史且肺部CT也未显示明显的钙化纤维增殖灶，T-SPOT.TB呈假阳性，可能与潜伏期结核分枝杆菌感染有关。考虑到我国是结核病高发国家，较大部分患者处于结核分枝杆菌潜伏感染状态长期处于休眠期而呈现结核感染潜伏状态。恶性肿瘤、强直性脊柱炎、应用免疫抑制剂患者本身可导致机体免疫力的下降，进而增加了结核分枝杆菌感染的风险。Zhu等[15]报道高危人群（非结核肺疾病患者）感染结核分枝杆菌的风险较一般人群大。文献报道[6]当感染堪萨斯分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、海分枝杆菌和戈登分枝杆菌时， T-SPOT.TB检测可能出现假阳性结果。

综上所述，T-SPOT.TB试验对活动性结核病诊断的灵敏度高，同时其属于体外实验，24～48h能够得到检测结果，安全快速。可作为活动性结核病诊断的筛选指标，但对高度疑似活动性结核病而T-SPOT.TB试验阴性结果时应注意患者是否存在免疫功能缺陷的情况。