高加索人群白癜风多态性位点与中国汉族人群白癜风发病的相关性研究

高 敏，张 敏，郑晓冬，周伏圣，李 扬

白癜风(vitiligo)是一种局限性或者泛发性的色素减退/脱失性疾病。多数学者认为白癜风是一种复杂疾病，遗传和环境因素共同作用从而导致白癜风的发生和进一步发展。前期研究[1]通过全基因组关联分析(genome wide association study, GWAS)的方法在中国汉族人群中发现染色体6q27的一个约200 kb的区域与中国汉族人群白癜风的发病显著相关，同时通过基因分型的方法检测了大量可疑的易感单核苷酸多态性(SNP)位点。

国外学者Jin et al[2]在1 514欧美高加索白人白癜风患者和813例与之相匹配的健康对照者中进行了GWAS研究，发现PTPN22、RERE、GZMB、C1QTNF6和UBASH3A这5个基因的多态性位点与白癜风的发病密切相关。为了验证这些基因是否与中国汉族人群白癜风发病具有相关性，该研究团队检索了白种人数据库，利用国际单体型计划(HapMap)中的Haploview软件，筛选了上述5个基因的8个SNP位点进行深入研究，以期探讨上述基因与中国汉族人群白癜风发病是否相关。

1 材料与方法

1.1病例资料

1.1.1入选标准 在全国范围内收集了汉族人群白癜风患者1 977例，其中男993例，女984例；年龄12～64(27.64±14.46)岁。确诊标准：所有病例经Wood灯检测后，由至少两位副高以上的副主任医师确诊。此外，收集健康对照人群2 024例，其中男1 081例，女943例；年龄14～65(26.20±12.27)岁，要求其亲属无白癜风以及其他自身免疫性或者系统性疾病。本研究符合赫尔辛基宣言原则且经安徽医科大学伦理委员会批准。每位入选人员抽取静脉血3～5 ml，置于EDTA-Na2抗凝管，放入-80 ℃冰箱保存。

1.1.2临床分组及分层分析 按照首次发病年龄划分：≤20岁称为早发型白癜风；>20岁称为晚发型白癜风。按照先证者一、二、三级家属中有无白癜风患者分为有家族史和无家族史患者两组。

1.2SNP位点的选择查阅文献以及UCSC、NCBI数据库，结合国际单体型计划利用Haploview软件，筛选出位于PTPN22、RERE、GZMB、C1QTNF6和UBASH3A这5个基因上的8个TagSNPs位点进一步研究。

1.3研究方法

1.3.1基因组DNA的提取和标化 参照Qiagen公司的Flexi Gene DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA，紫外分光光度计测其浓度后将其标准化至15～20 ng/μl备用。

1.3.2引物设计 在NCBI数据库中获取上述8个SNP位点的序列，利用Assay Designer3.1软件设计引物。上海生工合成引物后进行稀释待用。

1.3.3基因分型 PCR扩增获得DNA片段，经电泳、纯化后在Sequenom Massarray iPLEX系统(美国Sequenom公司)上对筛选出的8个SNP位点进行基因型分型。

1.4统计学处理PLINK 1.07软件进行Hardy-Weinberg(HWE)平衡检验和最小等位基因频率(MAF)计算。采用SPSS 16.0软件计算优势比(odds ratio，OR)、95%可信区间(confidence intervals，CI)和P值，组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1基因分型PTPN22、RERE、GZMB、C1QTNF6 和UBASH3A基因上的多态性位点rs2476601、rs301819、rs4908760、 rs11121194、rs8192917、rs5756546、rs11203203和rs2839511在1 977例白癜风患者和2 024例健康对照者间无显著相关性(P>0.05)，见表1。

2.2基因型-表型分析

2.2.1按照早发/晚发型分组 在1 977例白癜风患者中，早发型患者与晚发型患者两组之间的基因型以及等位基因频率分布上的差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2.2按照有/无家族史分组 207例患者具有家族史，1 764例患者无家族史，6例患者家族史不详。位于RERE基因上的SNP位点rs4908760的等位基因频率在有家族史和无家族史患者中差异有统计学意义(P=0.024)，基因型频率在两组患者之间差异性有统计学意义(P=0.012)(表2)，但对上述结果进行组间比较校正后，结果显示差异无统计学意义；位于GZMB基因上的SNP位点rs8192917的基因型频率在有家族史和无家族史患者之间差异具有统计学意义(P=0.008)，但其等位基因频率在两组之间差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

3 讨论

白癜风是一种多基因遗传的复杂性皮肤病，其发病机制未明，但是遗传因素在其发病机制中的作用得到广泛认同。近年来，随着分子生物学技术和高通量测序技术的飞速发展，白癜风的遗传学研究取得了较大的进展，尤其是国内外学者运用GWAS，发现了许多有意义的白癜风易感基因及位点[3]。 国外学者Spritz 团队完成了欧美人群白癜风的 GWAS研究，结果显示寻常型白癜风与某些自身免疫性疾病相关联的基因具有相关性，如本研究中的GZMB、RERE、PTPN22、UBASH3A和C1QTNF6基因。

表1 8个SNPs位点的等位基因频率在病例和对照组间的比较

表2 在有无家族史患者中rs4908760的基因型和等位基因分布

表3 在有无家族史患者中rs8192917的基因型和等位基因分布

PTPN22基因编码蛋白络氨酸磷酸酶家族非受体4型亚科。研究[4]显示该基因的多态性与类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病明显相关。Jin et al[2]研究发现其SNP 位点 rs2476601与欧美人群白癜风发病具有相关性。UBASH3A基因编码T细胞泛素配体家族，可以负向调节T细胞信号，与糖尿病的发病密切相关，其SNP位点rs11203203和rs2839511与欧美人群白癜风发病相关[5]。C1QTNF6基因是C1q和肿瘤坏死因子相关蛋白6，与中国汉族人群Graves’病的发生具有相关性，该基因的多态性位点rs5756546与欧美人群白癜风发病相关[6]。但是本研究中并未显示上述三个基因的多态性位点与中国汉族人群白癜风发病具有相关性。

RERE基因位于染色体1q36.23区域，该基因编码精氨酸谷氨酸的酸二肽重复蛋白质，其超表达可以诱发细胞凋亡，有研究[7]表明其与神经系统发育异常有关。Jin et al[2]研究发现RERE基因上的SNP位点rs1121194、rs4908760和rs301819与高加索人群白癜风的发病有关。本研究显示该基因上的SNP位点rs4908760的等位基因频率在有家族史和无家族史患者中差异有统计学意义(P=0.024)，基因型频率在两组之间也具有差异性，但是经过校正后，差异并无统计学意义。

GZMB基因又称颗粒酶 B，能够被细胞毒性 T 细胞和 NK 细胞识别，从而溶解特定的靶细胞，在细胞介导的免疫反应中发挥作用，有研究[8]表明该基因与类风湿性关节炎的发生具有相关性。国外学者发现其SNP位点rs8121917与欧美高加索人群白癜风发病有关[2]。本研究显示该SNP位点的基因型频率在有无家族史患者中存在差异(P=0.008)，但等位基因频率在两组患者之间无差异。

本研究并未显示上述8个SNP位点与中国汉族人群白癜风的发病明显相关，其原因考虑如下：① 遗传异质性：欧美高加索白种人群与中国汉族黄种人群在白癜风的遗传学发病机制中具有明显的遗传异质性，其特有的易感基因位点不是中国汉族人群白癜风的易感基因位点；② SNP 位点存在异质性：因为不同种人群的TagSNPs可能不同，并且TagSNPs无法覆盖整个基因，故而会导致中国汉族人群中的实验结果与欧美人群存在差异；③ 样本量可能不足：本研究显示某些致病SNP 位点对疾病的效力可能比较微弱，故而不一定能够被检测出，因此，以后可以通过进一步加大样本量以及提高SNP的密度来验证这些易感位点与中国汉族人白癜风发病的相关性。

该研究虽未能在中国汉族人群中成功验证RERE、PTPN22、GZMB、UBASH3A和C1QTNF6基因的多态性位点与白癜风的相关性，但并不表明这5个基因在汉族人白癜风发病中不起作用，如有可能，将来可通过全基因测序的方法来真正发现这些基因与汉族人群白癜风发病的关联。此外，由于白癜风发病复杂，环境因素在其发病中也起了至关重要的作用，将来可以通过其他手段，如蛋白质芯片、表达谱芯片和甲基化芯片从多方面来发现白癜风发病的病因，从而为早期诊断、干预和治疗奠定基础。