吴茱萸次碱对大鼠急性肾损伤氧化应激的影响及机制研究

王春华，俞百元，余又新，方林森，徐庆连，梁朝朝

急性肾损伤发生和进展中，氧化应激损伤起着重要的作用，通过抑制氧自由基产生及氧化应激反应可有效减轻缺血再灌注肾损伤。吴茱萸次碱(rutaecarpin，Ru)是中药吴茱萸的主要药理活性成分，研究[1-2]已证实其具有广泛的生物学活性，对于缺血再灌注(ischemia reperfusion injury，IRI)肾损伤的作用鲜有报道。该研究通过动物实验探讨吴茱萸次碱对大鼠急性肾损伤氧化应激的作用和可能机制。

1 材料与方法

1.1动物分组及模型制作100只SPF级成年雄性SD大鼠，体质量(250±10)g，购自安徽医科大学动物实验中心。随机分为5组：① 假手术组(Sham组)：给予大鼠麻醉、置管、打开腹腔，但是不造成肾缺血；② 肾缺血再灌注组(IRI组)：给予手术造成肾缺血再灌注损伤；③ 生理盐水组(NS组)：给予生理盐水预处理；④ 低剂量组(Ru-30组)：低剂量吴茱萸次碱预处理；⑤ 高剂量组(Ru-60组)：高剂量吴茱萸次碱预处理。吴茱萸次碱在使用前配制，用生理盐水作为稀释液，并通过过滤器进行过滤，于肾缺血前2 h经尾静脉注射给药或生理盐水进行预处理。NS组：手术前生理盐水10 ml/kg尾静脉微量泵滴注或静推；Ru-30组：手术前30 mg/kg的吴茱萸次碱(3 mg/ml)。按10 ml/kg尾静脉微量泵滴注给药；Ru-60组：手术前60 mg/kg的吴茱萸次碱按10 ml/kg尾静脉微量泵滴注给药。用4% 氯胺酮50 mg/kg腹腔注射，麻醉达成后，动物仰卧于恒温手术台。手术中根据麻醉深度的需要可追加首剂量的20%～25%。行尾静脉置管，接微量泵持续输注生理盐水或静推生理盐水或不同量的吴茱萸次碱进行预处理。注药或生理盐水2 h后，于大鼠腹部作正中切口打开腹腔，暴露并游离出肾脏，注意保护好输尿管免受损伤。采用无创动脉夹夹闭双侧肾的肾蒂，形成双侧肾缺血的状态，此时可用肉眼观察到肾脏的颜色由血红色快速转变为苍白色，这一结果说明肾缺血模型造模成功。然后缝合切口封闭腹腔。45 min后，再次于原处打开大鼠腹腔，小心处理使双侧肾蒂暴露出来，打开动脉夹，恢复肾脏血流的再灌注，此时可用肉眼观察到肾脏的颜色由苍白色快速转变回血红色，说明缺血后再灌注成功。假手术组在大鼠麻醉以及尾静脉置管后不夹闭双侧肾蒂，其他处理与动物模型组和给药组相同。手术后关闭腹腔让其自然苏醒，分笼饲养。

1.2标本采集于术后24 h后采取同样麻醉方法在麻醉下经颈椎脱臼处死全部受试大鼠。在处死大鼠前每只大鼠取血3 ml，均为尾静脉采血，3 000 r/min离心10 min后取血清放入-70 ℃低温冰箱中保存待测。处死大鼠后取两肾脏储存，备用。测定肾组织中丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)及血清中一氧化氮(nitric oxide，NO)、肌酐(creatinine，Cr)、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)水平。

表1 吴茱萸次碱对肾缺血再灌注损伤大鼠各指标的影响

与Sham组比较：*P<0.05，**P<0.01；与IRI组比较：#P<0.05；与NS组比较：▽P<0.05

2 结果

2.1各组受试大鼠肾组织匀浆中MDA和SOD含量检测肾缺血再灌注损伤时，肾组织中MDA含量增加，与肾功能的改变相一致，同时，肾组织中SOD活力下降，下降的程度与肾功能恶化的程度也相一致(P<0.05)。吴茱萸次碱处理后上述指标显著改善(P<0.05)。见图1。

图1 各组肾组织匀浆MDA、SOD含量

2.2受试大鼠血清中各指标的检测与Sham组比较， IRI组和NS组SD 大鼠的血BUN、Cr量显著提高(P<0.01)，提示肾功能严重受损。用 30 mg/kg 和60 mg/kg吴茱萸次碱处理后的大鼠其血浆中BUN、Cr 的水平与IRI组和NS组相比明显降低(P<0.05)，并呈剂量依赖性。与Sham组比较，IRI组、NS组受试大鼠血清的NO的量显著升高，而用吴茱萸次碱处理后，受试大鼠在肾缺血再灌注的过程中血清中NO量明显降低，且呈剂量依赖性，具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

3 讨论

肾缺血再灌注损伤的发生机制尚未完全阐明，是由多因素、多途径、多方面所介导的一个动态发展过程。其中氧化应激在急性肾损伤病程进展中具有重要地位。减轻氧化应激反应是治疗急性肾损伤的重要手段，中药吴茱萸次碱是一种天然生物碱，属于喹唑啉咔啉类，是吴茱萸的主要成分之一，基础研究及临床上均显示良好的抗炎和免疫调节作用[3]。研究[4-5]显示其具有广泛的药理学活性，包括抑制炎症介质、免疫调节、抑制氧自由基释放，抑制黏附分子的表达等。本研究通过建立大鼠急性肾损伤模型，从氧化应激反应与肾功能改变方面探讨吴茱萸次碱对急性缺血再灌注肾损伤的作用及机制。

本研究中，肾脏在缺血再灌注后，吴茱萸次碱各浓度组、IRI组与Sham组比较，血清BUN、Cr含量均升高，说明缺血再灌注过程中大鼠肾组织结构和功能严重受损。吴茱萸次碱各浓度组血清中BUN、Cr的含量显著降低，说明吴茱萸次碱预处理能够保护肾组织结构和功能，并且结果显示随着剂量的升高呈明显的缓解现象。氧自由基的大量形成以及脂质过氧化的过量增加是在肾缺血再灌注过程中导致肾细胞损伤的主要原因之一。氧自由基对所有的生物分子具有氧化损伤作用，尤其是脂质过氧化损伤细胞最为严重。MDA是脂质过氧化物反应的最终代谢产物。脂质过氧化在肾缺血再灌注时活跃， SOD活性降低，MDA生成量增高，则SOD活力的高低间接反映了机体消除氧自由基的能力，MDA含量的高低间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度[6-11]。本研究结果说明在吴茱萸次碱的干预下，肾缺血再灌注的过程中肾组织的氧自由基的生成明显减少，吴茱萸次碱能抑制由此激发的脂质过氧化反应，增加氧自由基的清除作用，从而减少氧自由基生成，减轻缺血再灌注后的肾脏损伤，因此，抗氧化应激反应可能是吴茱萸次碱对肾缺血再灌注损伤保护作用的可能机制之一。

NO是一个多功能调节因子，同时又是一个自由基，在正常生理条件下，NO的直接作用则是对脏器的保护作用，病理情况下其间接作用则是其毒性作用[12-14]。在肾缺血再灌注损伤的过程中，一氧化氮合成酶(nitric oxide synthetase，NOS)被激活，使得iNOS的表达上调，肾脏组织中产生大量的NO从而对肾脏形成直接的或间接的损伤。研究[15-19]表明，在肾缺血再灌注损伤的过程中，NO是介导肾小球损伤的主要因素之一。本研究结果中吴茱萸次碱预处理大鼠血清NO含量减低，并呈剂量依赖性关系，说明吴茱萸次碱对肾缺血再灌注损伤的保护机制可能是抑制NOS、减少NO的生成而发挥作用的。

本实验提示茱萸次碱对肾缺血再灌注损伤具有保护作用,抑制NOS、减少NO的生成及抗氧化作用可能是其潜在机制。