5,7,3’-三乙酰橙皮素对博来霉素致大鼠肺纤维化的影响及作用机制

谢小丽，李 俊

肺纤维化(pulmonary fibrosis，PF)是一种致死率极高的组织结构破坏性肺疾病。其病程包括肺泡上皮细胞损伤、异常增生、炎性细胞积聚，成纤维细胞增生，细胞外基质沉积及瘢痕组织形成。因其死亡率高于大多数肿瘤，平均诊断生存期仅2.8年[1]，是典型的“类肿瘤疾病”[2]。美国胸科学会和欧洲呼吸学会推荐的联合治疗包括皮质激素和硫唑嘌呤或环磷酰胺，但目前临床缺乏足够疗效证据。5,7,3’-三乙酰橙皮素(5,7,3'-triacetyl hesperidin，TAHP)为橙皮苷的结构衍生物，研究[3]显示其具有改善微循环、抗炎免疫、抗氧化等多重功效。该实验采用博来霉素诱导大鼠肺纤维化，观察TAHP对模型大鼠的治疗作用并探索其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 清洁级SD大鼠120只，雄性，体质量(200±20)g，由安徽医科大学实验动物中心提供。

1.1.2药品与试剂 博来霉素(bleomycin A5, BLM)购自哈尔滨博莱制药有限公司，批号：1108422，以生理盐水配成1 g/L溶液；TAHP由橙皮苷(云南药物研究所提供)合成并纯化，纯度>90%；醋酸地塞米松(dexamethasone, DXM)片购自浙江仙琚制药股份有限公司，批号：1109110；羟脯氨酸(hydroxyproline，HYP)试剂盒购自南京建成生物工程研究所；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)ELISA试剂盒购自美国R&D公司；PCR试剂盒购自美国Thermo Scientific公司；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.1.3仪器 uQuant全波长酶标仪购自美国Biotek公司；DL-5000B低速冷冻离心机购自上海安亭公司；高速冷冻离心机、Mastercycler. Ep型梯度PCR仪购自德国Eppendorf公司；Power-Pac HC型电泳仪购自美国伯乐公司；GSG2000Ⅱ型凝胶成像系统购自珠海黑马公司。

1.2方法

1.2.1动物分组 大鼠常规适应性饲养1周后，随机分为6组：对照组、模型组、TAHP组(50、100、200 mg/kg)及阳性药DXM 组(1.4 mg/kg)。

1.2.2模型建立 除对照组外，其余各组气管内一次性滴注博来霉素(5 mg/kg)复制大鼠肺纤维化模型，对照组用生理盐水代替。造模后第2天开始灌胃给药，每日一次，对照组和模型组给予等体积的0.5%羧甲基纤维素钠溶液。

1.2.3样本采集 造模后7、14、28 d大鼠分批麻醉后放血处死，分离肺组织，右肺经气管灌注10%中性甲醛后投入固定液固定用于病理学检测，左肺冻存于-80 ℃冰箱，待测生化指标。

1.2.4组织病理学观察 每组随机取6只大鼠肺组织固定24 h后，按常规制作蜡块、切片后进行HE染色和Masson染色。分别对7、14、28 d肺组织的肺泡炎、肺纤维化程度和胶原蛋白情况进行观察、分析。

1.2.5组织相关生化指标检测 按照相应ELISA试剂盒操作步骤检测组织中HYP、MDA、GSH及SOD的含量。

1.2.6TAHP对肺纤维化大鼠相关基因表达的影响 RT-PCR检测转化生长因子-β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)、平滑肌肌动蛋白α(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)、干细胞因子(stem cell factor，SCF)及干细胞因子受体(c-Kit receptor，c-Kit) mRNA的表达。PCR引物设计见表1，PCR扩增条件见表2。

表1 PCR引物和扩增长度

2 结果

表2 PCR反应条件

2.1肺组织病理观察变HE、Masson染色结果显示：各对照组肺组织结构清晰，肺泡上皮细胞结构完整，肺泡壁未见增厚，间质未见胶原沉积。模型组肺泡炎和肺纤维化现象明显，大量中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞向肺泡腔和肺间质浸润，肺间质内成纤维细胞积聚、肺泡间隔增宽，出现胶原沉积。且随着时间的推移、肺内胶原沉积逐渐加重，病变呈现从肺泡炎向纤维化转化趋势。DXM组的肺泡炎和肺纤维化程度较模型组减轻。TAHP各剂量组大鼠肺组织的炎性细胞浸润区域、成纤维细胞聚集程度和细胞外胶原沉积面积均较同时期模型组有所减小，且肺组织结构相对完整，显示肺泡炎程度和肺纤维化程度较模型组有不同程度的降低，高剂量TAHP组(200 mg/kg)控制炎症细胞浸润及肺纤维化程度与DXM组相当。结果见图1～3。

2.2TAHP对肺纤维化大鼠肺组织中MDA、SOD、GSH和HYP含量的影响与对照组比较，模型组大鼠肺组织中HYP和MDA含量显著升高(P<0.05)，GSH和SOD含量显著降低(P<0.05)；TAHP各剂量组大鼠肺组织中HYP和MDA含量较模型组有不同程度的降低(P<0.05)，GSH和SOD含量较模型组均有提升(P<0.05)，但未呈现明显剂量相关性，结果见图4。

2.3TAHP对肺纤维化大鼠相关基因表达的影响与对照组比较，模型组大鼠肺组织中TGF-β1、α-SMA、SCF和c-Kit mRNA表达升高(P<0.05)；与模型组比较，TAHP中、高剂量给药组(100、200 mg/kg)均能下调肺纤维化大鼠肺组织中TGF-β1、α-SMA、SCF和c-Kit的表达水平(P<0.05)。而TAHP低剂量给药组(50 mg/kg)对大鼠肺组织TGF-β1、α-SMA、SCF和c-Kit的表达水平无显著改变。结果见图5。

图1 TAHP治疗7 d后各组大鼠肺组织染色 ×200

A：对照组；B：模型组；C：TAHP 50 mg/kg；D：TAHP 100 mg/kg；E：TAHP 200 mg/kg；F：DXM 1.4 mg/kg；1：HE染色；2：Masson染色

3 讨论

目前模仿人类肺纤维化病理特点、动物造模的最常用技术是气管内滴注博来霉素复制肺纤维化模型。本实验模型组大鼠肺组织中有大量炎症细胞浸润、胶原聚积、纤维组织增生明显，肺泡间隔不规律性增宽、部分肺泡结构破坏、甚至消失，基本符合肺纤维化的解剖学特点，且反映胶原代谢的HYP含量明显升高说明大鼠肺纤维化模型制备成功。5,7,3’-三乙酰橙皮素能明显减轻肺纤维化大鼠的肺泡炎和肺纤维化程度、降低肺组织HYP含量等，说明5,7,3’-三乙酰橙皮素对于博来霉素诱导的大鼠肺纤维化有一定治疗作用。

图2 TAHP治疗14 d后各组大鼠肺组织染色 ×200

A：对照组；B：模型组；C：TAHP 50 mg/kg；D：TAHP 100 mg/kg；E：TAHP 200 mg/kg；F：DXM 1.4 mg/kg；1：HE染色；2：Masson染色

脂质过氧化是肺纤维化病程中关键的致病因素[4]。本实验中关于肺纤维化过氧化涉及的相关指标包括：SOD作为超氧阴离子自由基的中和剂，可维持机体的氧化与抗氧化平衡，对自由基启动的过氧化反应有较强的抑制作用。测定SOD可判断与评价机体自由基损伤程度与自由基清除剂药物的治疗效果。GSH作为一种重要的抗氧化剂，在谷胱甘肽过氧化酶催化下，其巯基能将细胞产生的H2O2还原成H2O，且在人类纤维化疾病和动物纤维化模型中，GSH含量明显降低，该值是衡量纤维化疾病程度的重要参数。MDA是脂质过氧化的最终产物，由机体内氧自由基攻击细胞膜的不饱和脂肪酸产生，该值反映组织过氧化损伤的程度。结果显示：在给予 5,7,3’-三乙酰橙皮素治疗后，肺纤维化大鼠组织中的MDA和HYP含量均有不同程度的降低，表明 5,7,3’-三乙酰橙皮素降低了肺纤维化大鼠的氧化损伤程度和胶原蛋白的含量；而给药组中SOD活力和GSH含量较模型组都有明显升高，提示 5,7,3’-三乙酰橙皮素可提高肺纤维化大鼠抗氧化损伤的能力。5,7,3’-三乙酰橙皮素的抗脂质过氧化功效为其防治肺纤维化提供药理学依据，但其干预作用是否呈剂量依赖性还有待进一步研究。

图3 TAHP治疗28 d后各组大鼠肺组织染色 ×200

A：对照组；B：模型组；C：TAHP 50 mg/kg；D：TAHP 100 mg/kg；E：TAHP 200 mg/kg；F：DXM 1.4 mg/kg；1：HE染色；2：Masson染色

肺纤维化是由多种细胞因子启动、持续性胶原蛋白代谢失衡造成的结果。TGF-β1是迄今发现的最强的细胞增殖调控剂和细胞外基质沉积促进剂[5]，研究[6-7]证实其介导的Smads、ERK信号通路在肺纤维化中起关键作用。α-SMA是肌成纤维细胞(myofibroblast, MFb)的标志性蛋白[8-9]，其表达水平可间接反映Fb向MFb转化增殖的程度。在本实验中，相较于模型组，5,7,3’-三乙酰橙皮素各剂量组均抑制大鼠肺组织中的TGF-β1和α-SMA的表达，说明 5,7,3’-三乙酰橙皮素能降低肺成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化，从而降低肺纤维化程度。其抑制TGF-β1 mRNA的异常高表达，可能与其抑制TGF-β1介导的下游信号通路、从而最终发挥抗肺纤维化作用有关。

图4 TAHP治疗7、14、28 d后各组大鼠肺组织中HYP、MDA、GSH和SOD的含量

图5 大鼠肺组织SCF、c-Kit、TGF-β1和α-SMA mRNA的表达

M：Marker;1：对照组；2：模型组；3：TAHP 50 mg/kg组；4：TAHP 100 mg/kg组；5：TAHP 200 mg/kg组；6：DXM 1.4 mg/kg

研究[8-9]表明，SCF/c-Kit信号转导通路的异常激活与各类细胞的异常增殖有密切关系。早期研究证实的与肺纤维化相关的ERK信号途径、JAK-STAT通路等[10-12]，均为SCF/c-Kit通路激活的下游信号转导通路[13]。但SCF/c-Kit通路与肺纤维化的关系尚缺乏研究。本实验结果显示：模型组大鼠肺组织中SCF、c-Kit的基因表达较对照组明显升高，提示SCF/c-Kit通路在博来霉素致大鼠肺纤维化的发生、发展中被激活。SCF为作用于最早期造血干/祖细胞的造血细胞因子，这与已获证实的肺肌成纤维细胞的分化与骨髓祖细胞招募相关的结论相吻合[14-16]。不同剂量 5,7,3’-三乙酰橙皮素的治疗使大鼠肺组织的SCF、c-Kit表达水平有所下降表明：5,7,3’-三乙酰橙皮素可能通过调控SCF/c-Kit干预肺纤维化。

综上所述，5,7,3’-三乙酰橙皮素对博来霉素致大鼠肺纤维化有一定的治疗作用，其机制可能与机体内抗氧化和抑制TGF-β1表达有关。结果显示SCF/c-Kit信号通路在博来霉素致大鼠肺纤维化中被激活，5,7,3’-三乙酰橙皮素对肺纤维化的干预作用可能与影响SCF/c-Kit有关。