β-TCP作用T淋巴细胞后调控BMSCs成骨分化的研究

许 敏，吴婷婷，何家才

免疫系统和骨骼系统紧密相关，免疫细胞直接或间接参与调控骨组织再生过程。T 淋巴细胞能够影响破骨细胞的增殖和分化。其中 Th17细胞及其分泌的白介素(interleukin,IL)-17A 在成骨与破骨平衡过程中的作用得到越来越多的研究。同时，研究[1]报道免疫细胞可介导生物材料的骨免疫反应过程。β-TCP 生物材料已被广泛研究应用于临床骨再生。研究[2]表明巨噬细胞参与β-TCP 介导的成骨分化。目前还没有研究报道T 淋巴细胞是否也参与了 β-TCP介导的骨组织再生过程。因此，该研究以β-TCP材料对T淋巴细胞的免疫调节作用作为切入点，探讨其对 Th17 细胞亚群分化的影响，同时检测 Th17 细胞分泌的IL-17A 对小鼠骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs) 成骨分化的调控作用，旨在为后期进一步的体内实验奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 SPF 级雄性 C57BL/6 小鼠，4 周龄，体质量(20±5) g，购自安徽医科大学实验动物中心。整个实验过程对动物的处置均符合医学伦理学标准。

1.1.2主要试剂和仪器 DMEM培养基、RPMI培养基、胰酶细胞消化液(美国Hyclone 公司) ；胎牛血清 (FBS) (美国Corning公司) ；Concanavalin A、PMA、茜素红染色剂 (美国Sigma公司) ；红细胞裂解液、钙离子霉素(北京Solarbio公司) ；autoMACS (德国Miltenyi Biotec公司) ；二氧化碳孵箱 (美国Thermo公司) ；CCK8试剂 (日本同仁公司)；台盼蓝染色剂、碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase, ALP) 试剂盒(上海碧云天公司) ；酶标仪 (美国Bio-tek公司) ；流式细胞检测仪 (美国Beckman Coulter公司) ；BFA (美国Selleck公司) ；倒置激光共聚焦显微镜 (日本Olymbus公司) ；PCR引物 (上海生工生物工程股份有限公司) ；实时荧光定量PCR仪 (美国Stratagene公司)；PVDF 膜(美国Invitrogen公司)。

1.2方法

1.2.1C57BL/6小鼠BMSCs的分离与培养 健康4周龄雄性 C57BL/6 小鼠，按照 Maniatopoulos et al[3]的方法，在无菌条件下去除表皮及肌肉等软组织，分离小鼠后肢股骨，剪去两端骨骺，采用注射器从骨髓腔两端将骨髓冲出，DMEM 完全培养基 (含10% FBS) 制成细胞混悬液，接种至培养皿中，在37 ℃、5 % CO2条件下进行培养，原代细胞生长7 d后待细胞融合达 80%～90%时使用0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.2.2C57BL/6小鼠脾淋巴细胞的分离与培养 小鼠脱颈处死，取右侧卧位，剪开表皮和皮下软组织，取出脾脏置于70 μm滤网上，加入适量红细胞裂解液研磨，3～5 min后加入4倍体积PBS缓冲液终止，1 500 r/min 离心5 min弃上清液，RPMI完全培养基 (含10% FBS) 重悬，conA (5 μg/ml) 刺激活化48～72 h。

1.2.3梯度浓度β-TCP 浸提液的制备 以 Ca(NO3)24H2O和 (NH4)2HPO4(均为上海国药集团) 为原始材料，采用化学沉淀法合成 β-TCP 粉末，方法如文献[4]所述。β-TCP 粉剂加入不含血清RPMI培养基，充分混匀，37 ℃摇床孵育24 h。1 500 r/min 离心10 min，取上清液，0.22 mm 滤网过滤除菌。根据文献[2]报道，将上清液依次对半稀释获得梯度浓度 β-TCP 浸提液 (200、100、50、25、12.5、6.25 mg/ml)。4 ℃保存。

1.2.4细胞活性检测 刺激活化48～72 h的T淋巴细胞5×103/孔接种于96孔板，每孔分别加入100 μl β-TCP浸提液 (0～200 mg/ml)。每组做3个重复孔，培养12、24、48、72 h，每孔分别加入10 μl CCK8 buffer，37 ℃孵育3 h，使用酶标仪在450 nm处读取吸光度值，所有定量检测重复测定3次。

1.2.5Th17亚群分化检测 autoMACS直接法免疫磁珠分选出CD4+T 细胞，接种于预先包被anti-CD3 (10 μg/ml) 4 ℃过夜的培养皿，同时加入anti-CD28 (5 μg/ml) 和IL-2 (20 μg/ml) 活化48～72 h。

CD4+T细胞2×106每孔，每孔分别加入2 ml β-TCP浸提液 (0～50 mg/ml) ，培养4 d。加入 PMA、BFA和钙离子霉素封闭4～6 h后，收集细胞进行流式细胞术或激光共聚焦检测，所有检测重复3次。

1.2.6上清液中IL-17A分泌量检测 按1.2.5方法培养4 d，收集孔内上清液，ELISA法检测上清液中IL-17A的分泌量，每组做3个重复孔，酶标仪450 nm波长处检测，所有定量检测重复3次。

1.2.7BMSCs成骨分化检测 小鼠 BMSCs 3×105每孔铺板，分别加入 β-TCP浸提液对T淋巴细胞作用后的上清液和同浓度的单独的β-TCP 浸提液，每3 d 换液一次，在第14天和第21天采用 qRT-PCR 实验检测ALP和骨钙素 (osteocalcin, OCN) 的基因表达水平，PCR引物委托上海生工生物工程公司设计，引物序列见表1。第21 天分别进行ALP 染色和茜素红钙结节染色，同时Western blot法检测ALP和OCN的蛋白表达，所有测定重复3次。

1.2.8IL-17A中和实验 在 β-TCP 浸提液对T淋巴细胞作用后的上清液中加入anti-IL-17A (10 μg/ml) 中和抗体，与小鼠BMSCs培养时加入，培养方法同1.2.7。此后每3 d换液一次，在第21天通过qRT-PCR技术检测 β-actin、ALP 和 OCN 的基因表达水平，第21天分别进行 ALP 染色和茜素红钙结节染色，同时Western blot实验检测ALP和OCN蛋白表达水平。所有测定重复3次。

表1 PCR引物列表

2 结果

2.1T淋巴细胞活性检测CCK8检测结果显示，培养72 h内，0～50 mg/ml的 β-TCP材料浸提液促进T淋巴细胞缓慢生长，100和200 mg/ml组明显抑制T淋巴细胞增殖；培养72 h，台盼蓝染色结果显示，与0 mg/ml组比较，浓度为100和200 mg/ml的 β-TCP材料浸提液组活细胞/死细胞比率接近零，细胞几乎全部死亡，具有明显细胞毒性，差异有统计学意义(F=105.042,P<0.05),见图1。

2.2β-TCP浸提液诱导Th17细胞分化流式细胞术结果表明，0～50 mg/ml的 β-TCP浸提液能够诱导Th17亚群分化，具有浓度依赖性，浓度为25 mg/ml时诱导产生Th17细胞比例最高，差异有统计学意义 (F=134.76,P<0.05)。细胞激光共聚焦结果表明，25 mg/ml组IL-17A荧光信号最强。ELISA结果表明，β-TCP浸提液浓度为25 mg/ml时上清液IL-17A分泌量最高，差异有统计学意义 (F=50.98,P<0.05) ，见图2。

图1 β-TCP浸提液对T淋巴细胞的细胞活性影响

A:CCK8实验；B:台盼蓝染色后活细胞/死细胞比率；1: 0 mg/ml；2: 6.25 mg/ml；3: 12.5 mg/ml；4: 25 mg/ml；5： 50 mg/ml；6： 100 mg/ml；7： 200 mg/ml；与0 mg/ml组比较：*P<0.05

2.3β-TCP浸提液对T淋巴细胞作用后上清液调控BMSCs成骨分化qRT-PCR实验结果表明，与阴性对照组比较，培养第14 天，0～25 mg/ml的上清液组ALP和OCN基因表达水平逐渐上升，其中25 mg/ml组ALP和OCN基因的相对表达水平分别为(3.07±0.22)(F=72.43，P<0.05)、(3.52±0.69)(F=196.76，P<0.05)；在第21天，25 mg/ml组的ALP (F=15.39，P<0.05) 和OCN (F=495.34，P<0.05)基因表达上调明显，差异有统计学意义。与同浓度的单独 β-TCP浸提液组比较，25 mg/ml诱导T细胞后上清液组分别在14 d 上调表达ALP (F=573.91，P<0.05) 和OCN (F=1 608.25，P<0.05)、第21天上调表达ALP (F=436.73，P<0.05) 和OCN (F=792.96，P<0.05)，差异具有统计学意义，表明 β-TCP浸提液对T淋巴细胞作用后调控BMSCs成骨分化效果更佳。与此同时，21 d的ALP染色和茜素红钙结节染色结果也表明相同结果。第21天的Western blot实验结果显示，阴性对照组ALP和OCN蛋白表达水平较低，在 β-TCP 浸提液作用于T淋巴细胞后，12.5～50 mg/ml上清液组ALP和OCN蛋白表达水平随浓度增加而上升，均在25 mg/ml时达到最大。见图3。

2.4IL-17A中和实验降低BMSCs骨向分化qRT-PCR结果显示第21天，与未中和上清液组比较，12.5～50 mg/ml IL-17A中和组ALP和OCN的基因表达水平下调，ALP和OCN基因的相对表达量为(1.803±0.639)(F=58.988，P<0.05)、(1.617±0.782)(F=77.682，P<0.05)，差异有统计学意义。第21天ALP染色、茜素红染色结果表明，25 mg/ml 时，与未中和上清液组和 β-TCP 浸提液组比较，IL-17A中和组阳性染色减弱。Western blot实验也表明，IL-17A中和组ALP和OCN 蛋白表达水平相对下降。见图4。

图2 β-TCP材料浸提液对T淋巴细胞的亚群分化作用

A：流式细胞技术检测细胞表面标志物CD4和IL-17A阳性表达情况；B：流式结果统计分析；1：0 mg/ml;2: 6.25 mg/ml; 3: 12.5 mg/ml; 4: 25 mg/ml; 5:50 mg/ml；C：细胞共聚焦检测细胞表面标志物CD4和IL-17A阳性表达情况 ×60；D：ELISA法检测共培养上清液中IL-17A分泌量；IgG- control: IL-17A抗体同源对照；1: 0 mg/ml；2：12.5 mg/ml；3：25 mg/ml；4：50 mg/ml；与0 mg/ml比较：*P<0.05

图3 β-TCP浸提液与T淋巴细胞作用后上清液对小鼠BMSCs成骨分化的影响

A、B：qRT-PCR技术检测ALP和OCN基因的表达；C：ALP染色和茜素红染色；D:Western blot法检测ALP、OCN蛋白表达；(-)：阴性对照组；与阴性对照组比较：*P<0.05

图4 IL-17A中和实验对小鼠BMSCs成骨分化能力的影响

A、B:qRT-PCR法检测ALP、OCN基因表达；C:ALP和茜素红染色；D:Western blot法检测ALP、OCN蛋白表达；(-)：阴性对照组；与阴性对照组比较：*P<0.05

3 讨论

β-TCP是一种具有良好生物安全性和降解性能的骨替代生物材料，被广泛用于临床骨缺损的再生修复治疗。2005年，Zerbo et al[5]将β-TCP用于临床上颌窦底提升术，由于植入材料后局部炎症反应和部分材料降解，临床疗效不理想。与炎症反应和生物材料的降解吸收有关的T淋巴细胞在宿主与骨替代生物材料的相互作用中发挥着重要作用。因此，研究骨替代材料对免疫细胞的调节作用，有利于开发“智能”骨替代生物材料[6]，创造促进成骨的免疫环境。本实验研究结果表明，6.25～25 mg/ml的 β-TCP浸提液能够诱导产生Th17亚群，具有浓度依赖性，表明 β-TCP浸提液对T淋巴细胞产生免疫调节作用，诱导促进Th17细胞分化。

众所周知，BMSCs是来源于骨髓的多能间充质干细胞，具有营养、抗炎作用和免疫调节、促进组织再生和抗凋亡等特性[7]。研究[8]显示，HIF-1α 介导的BMSCs在修复大鼠颅骨标准骨缺损中取得理想效果。然而Nauta et al[9]将BMSCs作为种子细胞，以羟基磷灰石磷酸钙作为支架材料体内成骨失败。因此，一定浓度的炎症细胞因子对于骨替代生物材料启动和促进BMSCs成骨分化是必需的。

IL-17A是Th17细胞分泌的主要炎性细胞因子。有研究[10]表明正畸诱导的牙髓炎症微环境中的IL-17A提高牙髓干细胞的自我更新和分化，也有学者称IL-17A能够促进人间充质干细胞的增殖分化能力[11]。本研究显示，β-TCP材料浸提液对T淋巴细胞免疫调节作用后的上清液中IL-17A浓度与小鼠BMSCs的成骨分化效果相关。上清液中的IL-17A调控小鼠BMSCs的成骨分化，刺激BMSCs释放成骨相关因子，ALP和OCN均呈现高水平上调，且能够持续高水平表达。其中，ALP是成骨分化的早期标志物，是骨矿化过程中发挥重要作用的酶[12]。OCN是成骨分化的关键基因。β-TCP作为公认的能够促进成骨分化的骨替代材料，已被证明具有明显的促进BMSCs成骨分化的能力。本研究为排除 β-TCP浸提液本身对成骨过程的影响，实验中设置了同等浓度的 β-TCP浸提液组和β-TCP浸提液作用于T淋巴细胞后的上清液组。通过图3的诱导实验及图4的抗体中和实验，均说明了β-TCP浸提液作用于T淋巴细胞后可增强 β-TCP成骨诱导效果。同时，IL-17A抗体中和实验后的小鼠BMSCs的成骨分化能力明显下降，表明IL-17A在提高小鼠BMSCs成骨分化能力中发挥着重要作用。

综上所述，β-TCP浸提液通过对T淋巴细胞的免疫调节作用，促进Th17亚群分化，呈浓度依赖性；Th17细胞分泌IL-17A介导小鼠BMSCs的成骨分化，为将来体内实验奠定基础。但目前为止，β-TCP材料诱导T淋巴细胞Th17细胞方向分化的具体分子作用机制尚不明确，且在体内β-TCP诱导成骨的机制是否依赖于对T细胞的调控，仍需要进一步研究。